Страница интересных статей

А.Д. Аммосов. Клещевой энцефалит. Кольцово. 2002г.

Содержание

1. Историческая справка
2. Этиология и распространенность инфекции клещевого энцефалита
2.1. Возбудитель инфекции и его переносчики в природе
2.2. Распространенность клещевого энцефалита
3. Проявления клещевого энцефалита и его последствия
3.1. Острая инфекция
3.2. Хроническая инфекция
4. Молекулярная биология вируса клещевого энцефалита
4.1. Морфология и структурно-функциональные характеристики флавивирусов
4.2. Организация генома ВКЭ и экспрессия структурных и неструктурных вирусных белков
4.3. Структура и функции белка Е
4.4. Репликативный цикл флавивирусов
5. Молекулярно-генетическая неоднородность и патогенность вируса клещевого энцефалита
5.1. Генотипы и серотипы вируса
5.2. Клинические особенности клещевого энцефалита по регионам распространения
5.3. Молекулярные основы нейровирулентности вируса
5.4. Молекулярно-генетическая гетерогенность изолятов вируса и их патогенность
6. Изучение патогенеза клещевого энцефалита
6.1. Репликативная, персистентная и интегративная инфекции
6.2. Размножение вируса в организме и особенности развития инфекции
6.3. Иммунитет и цитопатические механизмы инфекции
6.4. Патоморфология нейроинфекции острого и хронического клещевого энцефалита
6.5. Экспрессия антигенов НLA-комплекса и гуморальный иммунитет ВКЭ-инфекции
6.6. Развитие общей концепции патогенеза клещевого энцефалита и прогноз исхода инфекции
7. Методы и средства лабораторной диагностики клещевого энцефалита и их применение в клинической практике
7.1. ИФА Е антигена ВКЭ и антител к нему
7.2. ПЦР-анализ РНК ВКЭ
7.3. Лабораторная диагностика клещевого энцефалита
8. Средства специфической профилактики и лечения клещевого энцефалита
8.1. Средства вакцино- и серопрофилактики
8.2. Средства этиотропной терапии клещевого энцефалита
9. Заключение
Литература

1. Историческая справка

Открытие вируса клещевого энцефалита и начало всесторон­не­го изучения этиологически связанной с этим вирусом нейроин­фек­ции клещевого энцефалита составляют замечательные и одно­временно драматические эпизоды истории отечественной меди­цин­ской вирусологии. Эпидемия весенне-летнего клещевого эн­це­фалита была подтверждена и ее комплексное исследование нача­то на Дальнем Востоке экспедициями Наркомздрава бывшего СССР в 1937–1939 гг. В составе экспедиций вместе с вирусологами и инфекционистами из центра работали местные клиницисты-не­в­­рологи, хорошо зна­комые с характерной нейропатологией в ре­гионе.

Из мозга и ликвора умерших от тяжелой острой формы эн­­­це­фалитных больных, в анамнезе которых часто упоминался укус лесного клеща, вирусологами был выделен и впервые охарак­те­ризован ранее неизвестный вирус клещевого энцефалита (ВКЭ). Не­медленно были начаты исследования роли клещей в передаче при­родно-очаговой инфекции, пути циркуляции вируса и его при­родного резервуара. По единой программе комплексно изучались этиология, эпидемиология, клиника, иммунология и патомор­фо­­логия ВКЭ-инфекции, началась разработка методов её диагнос­ти­ки, лечения и вакцинопрофилактики.

Во время этих работ среди немалого числа тяжелых больных и умерших от клещевого энцефалита были и сотрудники научных экспедиций. В 1937 г. при вскрытии умершего больного один из пер­­вооткрывателей ВКЭ М.П. Чумаков заразился клещевым эн­це­фалитом и перенес энцефалополиомиелит. Острая инфекция со временем перешла в хроническую болезнь, которая протекала по­жизненно до 1993 г. Еще во время экспедиции М.П. Чума­ков по­казал возможность культивирования ВКЭ в тканевых фраг­мен­тах, и позже, в 1944 г., также впервые выделил вирус из кро­­ви хронического больного клещевым энцефалитом (кожевни­ков­ской эпилепсией). Несмотря на тяжелую болезнь с пораже­ния­­­ми слуха и шейной, правой плечевой зоны мозга, а в дальней­шем в конце 80-х годов с прогрессированием двигательных наруше­ний, академик М.П. Чумаков сохранял огромную трудо­способ­ность и высокий интеллект. По его завещанию было проведено уни­­­каль­­­ное посмертное исследование его мозга в отношении хрони­чес­кого клещевого энцефалита, протекавшего десятилетиями пос­ле первоначального инфицирования вирусом с манифестациями острой инфекции.

Как следует из воспоминаний участников экспедиций в пе­ча­ти, жертвы тогда приносились не только вновь открытой таеж­ной инфекции. В разгар работ руководитель первой экспедиции профессор Л.А.Зильбер, руководитель отряда А.Д. Шеболдаева и эпидемиолог Т.А. Сафонова были арестованы влас­тями по лож­ному обвинению, что экспедиция тайно распрост­ра­няла японский энцефалит на Дальнем Востоке.

В Европе клещевой энцефалит впервые был диагностирован в Чехословакии в 1948 г., и инфекция стала известна под назва­ни­ем центрально-европейский энцефалит. В отличие от Европы клещевой энцефалит в России назывался русским весенне-летним эпидемическим энцефалитом. Со временем, из-за общности этио­ло­гического источника, за этой широко распространенной ин­фек­­­цией повсеместно утвердилось общее название клещевой энце­фалит. Успешное лечение и изучение клинических осо­бен­ностей кле­­щевого энцефалита в течение многих лет проводились А.Г. Па­­­новым, А.Н. Шаповалом, А.А. Смородин­це­вым, А.П. Ие­­ру­салимским и др. В изучение молекулярной биологии, ге­но­типирование ВКЭ, в исследования глубоких связей между гетерогенностью генома природного клещевого пула вируса и ви­ру­­лент­ностью, патогенезом, клиническими и эпидемио­логи­чес­кими особенностями природно-очаговой нейровирусной инфекции клещевого энцефалита, а также в разработку ПЦР-анализа возбу­ди­теля инфекции значи­тель­ный вклад был сделан благодаря рас­шифровке первичной нуклеотидной последовательности полного генома и аминокислотной после­до­ва­тельности полипротеина ВКЭ, впервые проведенной А.Г. Плет­невым, В.Ф. Ямщиковым и
В.М. Бли­­новым. Другим значитель­ным событием в этих иссле­до­ваниях стали получение и изучение C.W. Mandl, F.X. Heinz, C. Kunz, Н. Holzmann, Е.К. Прессманом, Н.А. Цехановской, Л.Э. Матвеевым, А.А. Кущ и др. авторских серий моноклональных антител к основным антигенам этого ви­ру­са и применение их в ка­честве лабораторного инструмента высо­кого разрешения для исследований иммуногенных, пато­генных и других функ­цио­наль­ных свойств структурных и неструктурных белков ВКЭ, для диаг­нос­ти­ки инфекции.

Дальнейшее изучение клеточно-гуморального иммунитета, слож­ного иммуно- и нейропатогенеза висцерально-невральной инфекции и их связи с ге­­­не­тической неоднородностью возбудителя инфекции и на­сле­дуе­мыми особенностями системы иммунитета пациента наравне с современными клиническими исследованиями острого и хрони­чес­кого клещевого энцефалита составляют научную основу новых раз­работок методов и средств профилактики, диаг­нос­тики и лечения этой актуальной для здравоохранения при­род­но-очаговой нейровирусной инфекции.

2. Этиология и распространенность инфекции

2.1. Возбудитель инфекции и его переносчики в природе

Клещевой энцефалит или, по международному класси­фика­тору заболеваний МКБ-10, энцефалит весенне-летнего типа (таеж­ный) — вирусная инфекция, поражающая оболочку, серое и белое ве­щество и другие отделы головного и спинного мозга ЦНС, ко­­­решки спинномозгового нерва и периферические нервы, при­водящая к развитию парезов и параличей. При клещевом или али­ментарном заражении вирусом входными воротами организма человека служат кожа и подкожная клетчатка или клетки эпи­те­­лия пищеварительного тракта откуда вирус распространяется в организме по кровеносным, лимфатическим и (или) невральным путям, инфицирует клетки крови, органы иммунной системы, дру­гие внутренние органы и достигает мозга, который служит местом длительного размножения вируса и основным центром локализации патологического очага нейроинфекции. Клинически клещевой энцефалит, как правило, развивается в острой цикли­чес­кой форме с выздоровлением, однако, иногда со временем может трансформироваться в хроническую инфекцию. Не исключается раз­­витие инфекции и в первично-хронической форме. Тяжелые ос­­­ложнения острой инфекции (это в первую очередь территори­аль­но относится к Дальнему Востоку России) часто могут завер­шиться параличом и летальным исходом. Хроническая инфекция клещевого энцефалита с поражениями мозга протекает годами или пожизненно.

Природно-очаговая инфекция клещевого энцефалита этио­логически связана с вирусом клещевого энцефалита из семейства Flaviviridae, экологически относящимся к арбовирусам, переноси­мым членистоногими. Семейство вирусов Flaviviridae теперь вы­де­­лено из семейства Togaviridae и состоит из трех родов: фла­ви­вирусов ( Flavivirus), пестивирусов ( Pestivirus) и вирусов гепатита С и G ( Hepacivirus) [40, 41]. Эти три группы вирусов, хотя имеют различ­ные биологические свойства и не обладают сероло­ги­­ческой пере­крестной реактивностью, похожи и родственны меж­ду собой с точ­­ки зрения морфологии вирионов, организации вирус­ного ге­но­ма и предполагаемой стратегии репликации геномной РНК. Все три рода семейства флавивирусов одинаково характе­ризу­ют­ся инфекционной геномной РНК, сходной локализацией генов струк­тур­ных белков на 5’-конце геномной РНК, отсутствием спе­циали­зи­рованных геномных РНК, кодирующих белки вирио­нов, и образованием единого полипротеина-предшественника.

ВКЭ в числе тесно родственного антигенного комплекса виру­сов кле­щевого энцефалита относится к флавивирусам и чаще все­го переносится клещами вида I. persulcatus и I. ricinus. В неко­торых очагах ВКЭ переносится клещами H. concinna, D. sil­varum, D. pictus и др. Считается, что еще до 14 видов клещей яв­ляются носите­ля­ми вируса в природе, но их эпидемическая роль невелика. Ос­­новным резервуаром вируса в природе являются его главные переносчики, иксодовые клещи. Врожденная инфи­ци­рованность клещей поддерживает постоянный уровень вирусо­фор­ности этих насекомых. Дополнительным природным резервуа­ром вируса cлужат прокормители инфицированных клещей: многочисленные грызуны (полевая мышь, бурундук, заяц и др.), другие дикие и домашние животные, птицы. В природе вирус под­держивается постоянной циркуляцией по замкнутой цепи: клещи — животные-прокормители — клещи. Инфицирование че­ловека для ВКЭ яв­ляется биологически тупиковым направле­нием, поскольку вирус дальше не передается к другому организму и выходит из природной циркуляции.

Для клещевого энцефалита характерна строгая весенне-лет­няя сезонность начала заболевания, связанная с сезонной актив­ностью переносчиков. В ареале I. persulcatus заболевание прихо­дит­ся на весну и первую половину лета, май–июнь месяцы, когда наиболее высока биологическая активность этого вида клещей. Однако, как утверждается [23], на юге Дальнего Востока свеже­слинявшим имаго из нимф I. persulcatus необязательна генетически запрограммированная поведенческая диапауза, которая способ­ст­вует сезонному затуханию активности природного очага с этим носителем вируса в других регионах страны. Для клещей вида
I. ri­cinus отмечается подъем биологической активности дважды за сезон, и в ареале этого клеща характерны 2 пика сезонной за­­болеваемости клещевым энцефалитом: весной (май–июнь) и в конце лета (август–сентябрь). Инфицирование человека ВКЭ про­ис­ходит во время кровососания голодных вирусофорных клещей. Кровососание самки клеща продолжается много дней, и при пол­ном насыщении она увеличивается в весе 80–120 раз. Кровосо­са­­ние самцов длится обычно несколько часов и иногда остается не­замеченным. Передача вируса клещевого энцефалита может про­исходить в первые минуты присасывания высоковирусофорного клеща к человеку. Удаление клеща при сохранении «цементи­рующей пробки» из содержащей вирус слюны клеща в коже чело­века, по-видимому, полностью не устраняет передачу инфекции.

В одном высоковирусофорном клеще может содержаться преизбыточная доза возбудителя инфекции — до 1010вирусных частиц, из числа которых попадание в кровь человека одной мил­лионной доли вирусного пула может быть достаточно для раз­вития инфекции. Численность клещей во многих очагах Даль­него Востока и Сибири в среднем достигает 50–70 экз. на 1 км пе­шеходного маршрута, при индивидуальной зараженности (ви­русофорности) клещей в естественных (диких) природных очагах от 2 до 15%. Уровень вирусофорности отдельного клеща зависит от его возраста и степени напитанности. Максимальное содер­жа­ние вируса устанавливается у клещей предельных физиологических возрастов. Низкий уровень вирусо­форности у клеща наблюдается в фазе перехода его к активному состоянию. Доля клещей с высоким содержанием вируса среди напитавшихся особей значи­тельно выше, чем у голодных соро­дичей. На основании этого фе­­номена предполагается возможность ускоренного размножения вируса во время и после питания клеща. Концентрация вируса в I. persulcatus, напитавшихся на больных мышах, непрерывно воз­растает, достигая максимума к 40 дню. За этот период коли­чес­тво вируса возрастает в 1000 раз. В отличие от очагов инфек­ции в таежных территориях, в антропургических очагах ВКЭ-ин­фекции зараженность клещей вирусом достигает высоких пока­зателей: 24,5% — в Пермской области; 34,7% — в Кировской об­ласти; 57,8% — в Новосибирской области. При этом вирусо­фор­ность клещей по непонятной причине подвержена иногда очень резким межгодовым колебаниям в 2–3 раза [1].

Типичными ландшафтами природных очагов инфекции ока­зываются лиственные и смешанные хвойно-лиственные леса с выраженным подлеском и высоким травостоем, пойменные луга по берегам рек, берега озер и прудов, лесные просеки, придорожная растительность, лесные тропинки, создающие условия для частого на­хождения прокормителей клещей. Прокормителями половозре­лых клещей служат крупные виды животных, а для нимф и ли­­­­­чи­нок — мелкие мышевидные грызуны.

Заболевание в Европе и Сибири протекает в более легкой фор­ме, чем в восточной части ареала, особенно на Дальнем Вос­токе. Это дало основание впервые различить западный и восточ­ный типы клещевого энцефалита и, соответственно, их возбуди­телей. Возбудитель инфекции повсеместно принадлежит к одному виду вируса комплекса клещевого энцефалита флавивирусов и, тем не менее, клещевой пул вируса на каждой территории, как ста­ло известно со временем, состоит из смеси штаммов, разли­чаю­щихся генетически и серологически. Штаммы ВКЭ варьируют и по вирулентности, однако, долго не было убедительных данных по корреляции между вирулентностью и антигенными особен­нос­тями вируса. Некоторыми исследователями отмечалась боль­шая разница в патогенности и антигенных свойствах штаммов вируса, выделенных из I. persulcatus и I. ricinus. Другие не обна­ру­живали строгой зависимости между географией очага, видовыми различиями переносчиков и циркуляцией определенных вариантов вируса и их патогенностью [2]. При этом известно, что леталь­ность в Европейской части России в разные годы до последнего времени исчислялась в 1–3%, а на Дальнем Востоке роковые исходы наступали у 12–25% заболевших клещевым энцефалитом. Более того, широко известны низковирулентный вирус из ком­п­лекса вирусов клещевого энцефалита Лангат, аттенуи­рован­ный куль­туральный штамм Еланцев ВКЭ, кандидаты для произ­вод­ст­ва живых вакцин в прошлом, производственный штамм 205 для получения инактивированной вакцины и выскопато­ген­ный даль­невосточный штамм Софьин ВКЭ и др., выделенные в разных мес­тах циркуляции вируса в разное время.

Заражение человека клещевым энцефалитом происходит не только при укусе клещами. Также наблюдается алиментарный путь заражения при употреблении сырого, содержащего вирус мо­лока инфицированных коз и коров. Однако, в настоящее время до­ля этого пути в заражении людей, по сравнению с трансмис­сив­ной передачей ВКЭ-инфекции, незначительна.

2.2. Распространенность клещевого энцефалита

Инфекция клещевого энцефалита распространена по всей лес­ной и лесостепной умеренной климатической зоне Евразийского континента. Природные очаги этой инфекции имеются во всех странах западной, центральной, восточной и отчасти северной Ев­ропы, в частности, на Британских островах, во Франции, Гер­мании, Швеции, Австрии, Чехии, Словакии, Венгрии, Польше, при­балтийских странах. В Российской Федерации, где заболевание широко распространено, высокоэндемичными районами являются средний и южный Урал, юг Западной и Восточной Сибири, Дальний Восток (Приморский край). Очаги клещевого энцефалита распространены в Монголии и в северных провинциях Китая. Самый восточный природный очаг клещевого энцефалита выявлен на острове Хоккайдо в Японии. Совсем недавно, в 1995 г., там был диагностирован первый случай тяжелого клещевого энце­фалита. На рис. 1 представлена карта повсеместного распростра­нения вируса клещевого энцефалита с указанием раздельных зон, образуемых двумя основными видами клещей-переносчиков этой инфекции [43]. Географические зоны распространения клещей
I. persulcatus и I. ricinus на этой карте достаточно хорошо совпадают (за исключением Кавказа, Крымского и Апеннинского полуостро­вов, части Западной Европы и островов Великобритании) c кар­тами распространения этих клещей, ВКЭ и заболеваемости кле­щевым энцефалитом, опубликованными ранее А.Н. Шапо­ва­лом в 1980 г. [53] и Э.И. Коренбергом и Ю.В. Ковалевским в 1981 г. [52]. Отсюда можно делать вывод о расширяющемся аре­а­ле рас­п­ространения иксодовых клещей, носителей ВКЭ, и, по-видимому, соответствующем расширении территорий забо­леваемости кле­щевым энцефалитом в мире в последнее время.

Показатель заболеваемости клещевым энцефалитом на 100 тыс. населения в России постоянно растет в течение многих лет и достиг величины 6,7 в 1999 г. Однако, средний показатель по стране мало что говорит о высоком уровне распространенности инфекции в некоторых регионах страны. Во многих высокоэнде­мич­ных районах этот показатель в 1998 г. был равен: в Респуб­лике Удмуртия — 53,5, в Томской области — 39,2, в Крас­но­яр­ском крае — 37,0, в Новосибирской области — 19,6, в Иркутской области — 12,5, в Приморском крае — 9,8. Всего в 1998 г. в Рос­сийской Фе­дерации было зарегистрировано 7520 больных кле­щевым эн­це­фалитом, и из них у 118 человек наступил летальный исход. Ос­новная масса заболеваний приходится на Уральский, Западно-Си­­бирский и Восточно-Сибирский регионы. В этих регионах ре­гист­рируется 93% всех случаев заболевания клещевым эн­це­фа­ли­том в Российской Федерации. В последнее время забо­ле­вания кле­ще­вым энцефалитом стали выявляться и среди насе­ле­ния ра­­нее благополучных по этой инфекции Пензенской, Ярос­лавской, Магаданской, Камчатской областей и других территорий. Впервые зарегистрированы больные клещевым энцефалитом в Московской, Ивановской областях [26]. Численность хронических боль­ных кле­щевым энцефалитом официально до сих пор не регист­рируется.

Из общего числа заболевших клещевым энцефалитом до
75–80% больных составляют жители городов, заражение которых происходит в антропургических очагах (пригородной зоне) во вре­мя поездок по бытовым причинам, связанным со сбором грибов, ягод и работой и отдыхом на природе, дачных участках. Приса­сы­ва­ние клещей на человека может происходить не только в ле­су, но и в домашних условиях. Клещи заносятся в дом на ра­бочей одежде, с домашними животными, букетом полевых цве­тов и т.д. Отмечается переползание клещей среди пассажиров го­род­ского транспорта. В последнее время рост заболеваемости кле­щевым энцефалитом в России связан, возможно, не только с ростом численности неиммунного населения городов, часто кон­так­тирующего с природой, а также в какой-то степени объясняется и ростом показателей зараженности клещей вирусом. Имеется пред­положение о том, что рост заболеваемости клещевым энце­фа­литом может быть связан также с ростом вирулентности кле­щевого пула ВКЭ в отдельных очагах инфекции.

3. Проявления клещевого энцефалита и его последствия

3.1. Острая инфекция [2, 3, 17, 18, 53]

Инкубационный период при первичном инфицировании ВКЭ составляет 8–23 дня (чаще 10–12 дней). Изредка наблюдаются про­­дромы: слабость, недомогание, головная боль, тошнота, нару­шения сна. Отмечаются скоропреходящая слабость в конечностях, мышцах шеи, онемение кожи лица и шеи. Клинические прояв­ления клещевого энцефалита многообразны, течение вариабельно. Болезнь часто начинается остро, с озноба и повышения тем­пе­ра­ту­ры тела до 38–40°С. Лихорадка длится от 2 до 10 дней. Появля­ются общее недомогание, резкая головная боль, тошнота и рвота, раз­битость, утомляемость, нарушения сна. В остром периоде отме­чаются гиперемия кожи лица, шеи и груди, слизистой оболочки ротоглотки, инъекция склер и конъюнктив. Беспокоят боли во всем теле и конечностях. Характерны мышечные боли, особенно значительные в группах мышц, в которых в дальнейшем обычно возникают парезы и параличи. Иногда им предшествуют онемение, парестезии и другие неприятные ощущения. С момента начала бо­лезни может возникать помрачнение сознания, оглушенность, усиление которых может достигать степени комы. Обычно ха­рак­­терна разной степени оглушенность (сопор). Тем не менее бо­­лезнь часто протекает в легких, стертых формах с коротким ли­хо­­радочным периодом.

В типичных случаях острый период клещевого энцефалита продолжается 6–8 дней, но иногда — от 3 до 14 дней. Нередко в мес­те присасывания клещей появляются разного размера эритемы. Однако, так называемая мигрирующая кольцевая эритема часто является клиническим маркером другой инфекции — клещевого боррелиоза или болезни Лайма, также переносимой клещами. У больных клещевым энцефалитом отмечается снижение секретор­ной функции желудка, антитоксической, поглотительно-экскре­торной, углеводной, белокобразующей функций печени. Наблю­дается лихорадочная альбуминурия. В периферической крови отмечается умеренный лейкоцитоз и увеличенная СОЭ.

С первых дней течение острого клещевого энцефалита носит токсико-инфекционный характер. Симптоматика складывается из трех основных синдромов: общего инфекционного, менин­ге­аль­ного и очагового поражения нервной системы. Несмотря на мно­гообразие проявлений острого периода клещевого энцефалита, в каждом отдельном случае можно выделить ведущий синдром болезни. Исходя из этого, а также учитывая выраженность и стой­­кость неврологических симптомов, выделяют три основные клинические формы болезни: лихорадочную, менингеальную и очаговую менингоэнцефалитическую. Дополнительно могут диаг­ностироваться менее распространенные полиомиелитическая и полирадикулоневротическая формы, утяжеление клинической кар­тины заболевания, особенно очаговых форм болезни с появ­лением крайне тяжелых синдромов многоуровневого поражения ЦНС в виде энцефало-полиоэнцефаломиелитического и др.

Лихорадочная форма болезни характеризуется благоприятным течением с быстрым выздоровлением. Продолжительность лихо­рад­ки — 3–5 дней. Основными клиническими признаками ее яв­­­ля­ют­ся токсико-инфекционные проявления: головная боль, сла­­­­бость, тошнота при слабовыраженной неврологической сим­п­то­­ма­тике. Показатели ликвора — тканевой жидкости, которая омы­­вает головной и спинной мозг в пределах гематоэнце­фа­ли­ческого барьера, — без отклонения от нормы.

Менингеальная форма является наиболее часто выявляемым про­явлением клещевого энцефалита. Больные жалуются на силь­ную головную боль, усиливающуюся при малейшем движении го­ловы, головокружение, тошноту, однократную или многократ­ную рвоту, боли в глазах, светобоязнь. Больные вялы и затормо­же­­ны. Определяется ригидность мышц затылка, симптомы Кер­ни­га и Брудзинского. Менингеальные симптомы держатся на про­тяжении всего лихорадочного периода. Иногда они проявляются и при нормальной температуре. В ликворе определяется умеренное повышение содержания лимфоцитов, повышение концентрации белка. Внутричерепное давление повышено. Изменения в спин­номозговой жидкости, возникшие в остром периоде болезни, могут сохраняться длительное время, даже в период выздоровления. Длительность лихорадки — 7–14 дней. Исход всегда благопри­ят­ный.

Менингоэнцефалитическая очаговая форма клещевого энце­фалита протекает тяжело и дает частую летальность. Больные вя­­лы, заторможены, сонливы, жалуются на сильную головную боль, тошноту и рвоту. Выражены ригидность мышц затылка и симп­томы Кернига и Брудзинского. Нередко наблюдаются бред, галлюцинации, психомоторное возбуждение с утратой ори­ен­ти­ров­ки на месте и во времени. Могут быть эпилептиформные при­падки. Судороги повторяются несколько раз в сутки, иногда раз­ви­вается эпилептический статус. При менингоэнцефалитической форме характерно появление гемипарезов, подкорковых гипер­кинезов, стволовых расстройств, а также очаговых поражений черепных нервов: III, IV, V и VI пар, несколько чаще VII, IX, X, XI и XII пар. Позднее может развиться кожевниковская эпилеп­сия, когда на фоне постоянного гиперкинеза развиваются общие эпилептические припадки с потерей сознания. При исследовании спин­номозговой жидкости в остром периоде отмечается лимфо­цитоз и повышенное содержание белка.

Таким образом, при тяжелой энцефалитной форме болезни ведущие очаговые симптомы поражения ЦНС выявляются на фо­не общемозговых и токсико-инфекционных проявлений. После острого клещевого энцефалита очаговой формы период выздо­ров­ления длительный, до 2 лет. Развившиеся атрофические пара­личи мышц восстанавливаются частично.

Клинически особый вариант развития острой инфекции пред­ставляет клещевой энцефалит с двухволновым течением. Болезнь начинается остро ознобом, появлением головной боли, тошноты, рво­ты, головокружения, болей в конечностях, нарушением сна, анорексией и наличием характерной двухволновой лихорадки. Первая лихорадочная волна продолжается 3–7 дней, характе­ри­зуется легким течением. Отмечаются слабовыраженные оболочеч­ные симптомы без поражения черепно-мозговых нервов. Измене­ния в ликворе не определяются. На фоне интоксикации отмечают­ся вегетативные расстройства. В периферической крови — лейко­пения и увеличенная СОЭ. За первой волной следует период апирексии, длящийся 7–14 дней. Вторая лихорадочная волна на­чинается так же остро, как и первая, температура тела под­ни­ма­ется до высоких значений. Больные вялы, заторможены, появ­ляются тошнота, рвота, легкие менингеальные и очаговые сим­птомы поражения ЦНС. В периферической крови — лей­коцитоз, по­вышается содержание белка и сахара. Это качественно новая фаза болезни, и она всегда протекает тяжелее, чем первая, и длит­ся дольше. В разные годы рецидивы лихорадочных состоя­ний возникали на Дальнем востоке у 6–9% заболевших, в За­пад­ной Сибири — у 15–22%, в районах Урала — у 28–50% [3, 18]. Наиболее характерные клинические особенности этого ва­ри­анта клещевого энцефалита — двухволновое течение менингоэн­цефалита с вполне благоприятным исходом, без наслоения оча­говых двигательных поражений. Множественные случаи легких заболеваний с выраженным менингеальным синдромом и легкими энцефалитическими поражениями были выявлены и изучены в Ленинградской области и Республике Удмуртия в 50–70-х годах прошлого века. С уче­том характерных клинических особенностей заболевание было названо А.А. Смородинцевым двухволновым ме­нингоэнцефалитом и выделено как самостоятельный клинико-нозогеографический вариант клещевого энцефалита [53].

А.П. Иерусалимский в своем руководстве для врачей [1] кли­ническую классификацию острого периода клещевого энце­фа­лита представляет в виде следующих семи форм: лихорадочная; менингеальная; менингоэнцефалитическая (очаговая или диффуз­ная); полиоэнцефалитическая; полиоэнцефаломиелитическая; полио­миелитическая; двухволновое течение (с указанием формы второй волны). По мнению автора, по клиническим параметрам можно достаточно четко разделить лихорадочную форму и формы с поражением оболочек и вещества мозга. Эти последние уже менее четко можно разделить на менингеальную форму и очаговые формы. А вот все очаговые формы дифференцируются между собой очень трудно, в какой-то степени условно, по ведущему, наиболее функционально значимому синдрому.

У подавляющего большинства первично инфицированных возникают инаппарантная, субклиническая или стертая формы кле­щевого энцефалита. На территории Приморского края у каж­до­го четвертого укушенного клещом выявляется инфекция кле­ще­вого энцефалита без клинических проявлений в виде про­дол­жи­тельной антигенемии ВКЭ в лейкоцитах и в объеме пери­фе­ри­чес­кой крови [23]. Это основной путь «проэпидемичивания» и об­разования иммунитета у коренного местного населения эн­де­мич­ных районов. Иногда вовремя не выявленные формы инфекции мо­гут завершаться длительным вирусоносительством, которое мо­жет служить причиной редкого возникновения и развития так на­зываемой первично-прогредиентной и, по-видимому, затем — пер­вично-хронической инфекции клещевого энцефалита.

Выздоровление после перенесенного острого клещевого энце­фа­лита происходит в зависимости от формы проявления инфек­ции, ее тяжести. Изменения внутренних органов полностью исче­за­ют в отдаленные сроки выздоровления.

3.2. Хроническая инфекция [1, 14, 53]

Клещевой энцефалит относится к группе острых циклических инфекций, наделенных выраженной способностью к полному ос­вобождению от возбудителя при выздоровлении, с преиму­щест­венным формированием пожизненного иммунитета у перенесших не только манифестную, но и бессимптомную форму инфекции. Однако, у некоторых боль­ных формирование очагового синдрома выявляется в более поздние сроки болезни спустя недели или даже месяцы после снижения температуры до нормального уровня, в периоде реконвалесценции. В подобных случаях клещевой энце­фалит приобретает прогре­ди­ен­тный характер. В спинномозговой жидкости продолжают удер­живаться изменения воспалительного характера. При исследо­ва­нии крови также отмечаются умеренное увеличение СОЭ, неболь­шой лейкоцитоз, обычно со сдвигом ее формулы в сторону абсолют­ного и относительного лимфоцитоза. У части больных прогреди­ент­ная инфекция, как и в случае длительного бессимптомного ви­­русоносительства, постепенно трансформируется в хронический клещевой энцефалит.

Представления о хроническом клещевом энцефалите обос­но­ваны длительной персистенцией ВКЭ у лиц, страдающих явны­ми симптомами этой инфекции в течение ряда лет, десятилетий или пожизненно. К этим лицам часто относятся больные с кли­ническим диагнозом гиперкинетический синдром, кожевниковская эпилепсия, боковой амиотрофический склероз, эпидемический энцефалит, арахноэнцефалит, сирингомиелия, прогрессирующий полиэнцефаломиелит и др. Персистенция ВКЭ при этих недугах может устанавливаться иммуноферментным анализом вирусного антигена или прямым выделением реплицирующегося вируса на культуре клеток. Однако, наиболее надежным способом выявле­ния хронической инфекции клещевого энцефалита является
ПЦР-ана­лиз вирусной РНК в исследуемых образцах крови или ткани пациента.

По клиническим данным, частота трансформации в хрони­чес­кую инфекцию составляет 3–11% к общему числу заболеваний острым клещевым энцефалитом. Однако, в некоторых очагах ин­­фекции в частоте трансформации острого энцефалита в хрони­ческий могут быть более значительные отклонения в ту или иную сторону.

4. Молекулярная биология вируса клещевого энцефалита

4.1. Морфология и структурно-функциональные
характеристики флавивирусов

Возбудитель острого и хронического клещевого энцефалита — ВКЭ — как и вирионы всех флавивирусов, имеет сферическую фор­му диаметром до 50–60 нм, покрытую гликопротеиновой обо­лочкой. Внутри внешней оболочки размещается вирусный капсид — геномный нуклеопротеиновый комплекс, покрытый коровым бел­ком диаметром около 30 нм. В своем составе ви­русная частица со­держит 68% белка, 8% РНК, 17% липидов и 9% уг­ле­­­водов.

Неионные детергенты, такие, как тритон-Х, солюбилизируют оболочку вируса, удаляя все белки оболочки; дезоксихолат натрия снимает только бислойную мембрану внешней оболочки, оставляя коровый белок ассоциированным с нуклеокапсидом вируса. Об­ра­ботка протеазами выявляет, что якорная часть гликопротеина оболочки вируса утоплена в липидном бислое. Оболочка флави­вирусов защищает геном вируса от внутриклеточных протеаз, а раздетый нуклеокапсид деградируется рибонклеазами. Во внешней среде в составе мозговой суспензии на физиологическом растворе полностью собранная частица ВКЭ сохраняет жизнеспособность при комнатной температуре до 10 дней. Вирус устойчив в кислой среде, в частности, в составе желудочного сока; вирус в крови или его суспензия в белковом растворе инактивируются при 56°С в течение 30 мин. Кипячение убивает вирус в течение 2–3 мин. В глубоко за­мороженном виде или лиофилизированном состоянии в вакууме вирус сохраняет жизнеспособность многие годы. Бла­годаря би­слойной липидной природе оболочки вирус чув­ст­вителен к эфиру, растворам лизола, спиртам.

Геном флавивирусов в составе нуклеокапсида представлен одной молекулой однонитчатой РНК положительной полярности общей длиной около 11 тыс. нуклеотидов, кото­рые кодируют по­ли­пептидную цепь длиной 3,4–3,6 тыс. амино­кислотных ос­тат­ков (а.о.). Вирусная РНК cодержит 7-метилгуано­зиновый кэп на 5’-конце. Геномная РНК служит в качестве мРНК для внутри­кле­точного синтеза вирусных белков. Для сборки зре­лого флави­вируса синтезируются 3 вирусных структурных белка: капсидный белок С, мембранный белок М и поверхностный белок Е. Не­зре­лые внутриклеточные вирусные частицы содержат глико­зи­ли­ро­ван­ный белок-предшественник рreM. Кроме того, в геноме флави­ви­русов закодированы неструктурные белки NS1-NS5, ви­русная РНК-полимераза, которые обнаружены в инфи­ци­рованной клетке и участвуют в репликации вируса. В геноме все белки закоди­ро­ва­ны последовательно в виде одной открытой рамки счи­тывания. Индивидуальные белки вируса образуются в результате ко- или пост­трансляционного расщепления единого вирусного полипро­теи­на-предшественника протеазами вирусного или кле­точного про­ис­хождения.

В репликативном цикле геномная РНК является инициа­тором инфекционного процесса и служит матрицей для создания дочерних копий.

4.2. Организация генома ВКЭ и экспрессия структурных и неструктурных вирусных белков

Нуклеотидная последовательность всего генома ВКЭ и полная ами­нокислотная последовательность полипротеина вируса рас­шифрованы Плетневым с соавторами [19]. На рис. 2 представлена линейная генетическая карта вируса с указанием кодируемых генов всех структурных и неструктурных белков и концевых не­транслируемых областей генома ВКЭ штамма Софьин. Этот штамм вируса выделен от больного на Дальнем Востоке еще в 1937 г., прошел несколько десятков пассажей на лабораторных жи­вотных и пермиссивных клетках. Широко известен как про­то­типный штамм регионального дальневосточного генетического субтипа или антигенного серотипа ВКЭ.

Немного позже были расшифрованы полная нуклеотидная по­следовательность генома ВКЭ западного штамма Neudoerfl (Найдорф) [25], дальневосточного штамма 205 [30] и другого ви­­руса из антигенного комплекса ВКЭ — вируса Повассан [73].

Длина одноцепочечной РНК генома ВКЭ штамма Софьин сос­тавляет 10477 нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов содержит единственную открытую рамку считывания белка (поз. 127–10363), кодирующую 3412 а.о. полипротеина. С 5’-кон­ца генома 126 нуклеотидов предшествуют инициирующему тран­с­крип­цию кодону AUG; затем следует открытая рамка считывания полипротеина-предшественника всех структурных и неструк­тур­ных белков вируса длиной 10236 нуклеотидов. В другом конце полинуклео­тидной последовательности геномной РНК пред­став­лены UAA-стоп кодон и 112 нуклеотидов её 3’-нетранслируемой области.

Первым с N-концевой части полипротеина ВКЭ находится нук­леокапсидный кор-белок С, состоящий из 111 а.о. Моле­ку­ляр­­­ная масса белка С равна 12108 Da. При сборке вируса он вмес­те с геномной РНК образуют центральную структурную компоненту нуклеокапсида. Коровый белок обогащен остатками основных аминокислот: доля остатков аргинина и лизина, по-видимому, необходимых для нейтрализации зарядов на РНК при ее упаковке в нуклеокапсид, составляет 21,4%. Следующим от N-конца фрагментом полипротеина, выщепляемым протеазами, является гликопротеин preM-полипептид длиной 168 а.о. PreM яв­ляется только предшественником в синтезе вирионного бел-
ка М, его нет в составе зрелого вириона в крови, не удается об­­на­ружить его и в зараженных вирусом клет­ках. Мембранный белок М, содержащийся в составе оболочки зре­лого вируса, пред­ставлен 75 остатками аминокислот, имеет мо­ле­кулярную массу 8209 Da. В С-концевой части белка нахо­дятся два гидрофобных уча­стка, разделенных остатком аргинина. Подобные последо­ва­тельности имеются в белках М всех пред­ставителей флавивирусов. По-ви­ди­мому, они обеспечивают этим белкам трансмембранную лока­лизацию и важны для посттранс­ля­ционной модификации.

Следующим отщепляемым от предшественника полипеп­ти­дом является наиболее важный поверхностный вирионный бе-лок Е. Полипептидная цепь белка Е, включающая 496 а.о. с мо­леку­лярной массой 53680 Da, заканчивается двумя гид­ро­фоб­ны­ми участками, вероятно, служащими трансмембранным «яко­рем» белка. Белок Е слабоосновный, так как 47 остатков аспа­ра­гина и глутаминовой кислоты приходятся на 50 остатков основ­ных ами­нокислот. Считается, что процессинг полипротеина между белком Е и неструктурным белком NS1 осуществляет связанная с мембранами аппарата Гольджи протеиназа. Структура сайта про­теолиза между этими белками высококонсервативна у всех фла­вивирусов. С учетом вклада гликозилирования (2 % от массы бел­ка) молекулярная масса гликопротеина Е составляет
55000 Da. В вирионном белке Е гликозилирование происходит только по одному месту (поз.154 а.о.) полипептидной цепи. Нук­лео­тидная последовательность генов структурных белков ряда фла­вивирусов была опубликована ранее [20, 21].

Расщепление полипротеинов флавивирусов протеиназой со специфичностью к последовательности Val-X-Ala, расположенной на расстоянии (–3)–(–1) от места гидролиза, обеспечивает фор­мирование N-концов белков NS2A и NS4B. По мнению авторов [19], кроме такого типа протеолиза полипротеинов флавивирусов формирование N-концевых последовательностей белков NS3, NS4A и NS5 осуществляет, по-видимому, вирусспецифическая протеиназа по последовательности, обогащенной остатками ос­нов­ных аминокислот, которым предшествуют протяженные гид­рофобные участки полипротеинов. Функцию вирусспе­ци­фической протеиназы могут, вероятно, выполнять белки preM или NS1, так как в их составе присутствуют последовательности Cys-Trp, час­то встречающиеся в активных центрах тиоловых про­теиназ. Учет этих двух типов гидролиза полипротеинов флавивирусов приводит к локализации семи неструктурных белковых продуктов (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5), наблюдаемых в инфицированных флавивирусами клетках, в том числе и при ре­п­ликации ВКЭ.

Низкомолекулярные белки NS2A, NS2B, NS4A и NS4B с М 24873, 14531, 16063 и 27585 Da, соответственно, — это гидро­фоб­ные белки с протяженными участками остатков незаряженных аминокислот. Функции этих молекул в развитии вируса в клетках только выясняются. Более высокомолекулярные белки NS1, NS3 и NS5 легко обнаруживаются в инфицированных флавивирусами клетках, в сыворотке крови или спинномозговой жидкости боль­ных клещевым энцефалитом.

Нестуктурный белок NS1 (M 39162 Da) является глико­про­теином и обладает иммуногенными свойствами. Комплекс белка NS1 с гликопротеином Е отсутствует в зараженных клетках, не­смот­ря на накопление индивидуальных составляющих его субъ­единиц, только секретируется в сыворотку крови [76]. Внекле­точ­ная локализация комплекса на поздних стадиях инфекции исклю­чает его участие в созревании вирионов и создает оптималь­ные условия для индукции синтеза вирусспецифических антител. Эти антитела способны вызвать комплемент-зависимый лизис инфицированных вирусом клеток. С другой стороны, фрагменты белка NS1 экспонируются на поверхности инфицированных ВКЭ клеток и индуцируют эффекторные CTL клеточного иммунитета. Предварительная иммунизация животных белком NS1 ВКЭ, ви­русов лихорадки Денге и желтой лихорадки приводит к защите животных от высоких доз заражения этими вирусами. Однако, в сы­воротке крови животных, иммунизированных NS1 ВКЭ, не обнаруживают вируснейтрализующих антител. Известно, что мутации в NS1 влияют на вирулентность флавивирусов. Пред­по­лагается, что NS1 также воздействует на ранние процессы репликации. В инфицированной клетке этот белок обнаружи­ва­ет­ся в димерной форме, либо во фракции белка с М 49000 Da. По­следняя, по-ви­­димому, представляет собой слитую форму
NS1-NS2A, которая за счет гидрофобности цепи NS2A при­об­ре­тает способность удер­жи­ваться на клеточных мембранах.

Второй крупный неструктурный белок NS3 (68949 Da), воз­можно, обладает протеазной, геликазной и рибо-НTФ-азной актив­нос­тями. В составе третьего крупного неструктурного белка NS5 (102639 Da) всех флавивирусов присутствует последовательность, характерная для РНК-зависимых РНК-полимераз вирусов жи­вотных и растений: Gly-Asp-Asp. Белки NS3 и NS5, по-видимому, необходимы для репликации вирусной РНК, так как в зараженных клетках они находятся в околоядерной области в составе комп­лек­са с репликативной формой вирусного генома. Ассоциация комп­лекса с мембранами эндоплазматического ретикулума хозяйс­ких клеток исключает возможность контактов с системой иммуни­тета и обеспечивает репродукцию ВКЭ в организме. Изменение со­отношения составляющих субъединиц комплекса может вызы­вать переключение синтеза РНК с цепей отрицательной поляр­ности на цепи положительной полярности [76].

Разумеется, из всех белков ВКЭ более полно изучен струк­турный белок Е.

4.3. Структура и функции белка Е

Белок Е — главный, биологически наиболее значимый ком­по­нент внешней поверхности оболочки вириона. Он играет ключе­вую роль в процессах сборки вирусной частицы, в связывании вируса с клеточной поверхностью и последующем слия­нии ви­русной и клеточной мембран — определяет тропизм вируса. При сборке вириона нуклеокапсид вирусной частицы диаметром
26–30 нм, состоящий из вирусной РНК и внутривирусного нук­лео­капсидного белка С, заключается в липидный бислой, проис­хо­дящий из плазматической мембраны клетки-хозяина и вирус­ных поверхностных белков preМ и Е. Таким образом, гликопро­теин Е и белок preМ (после созревания и выхода вируса из клетки — белок М) включены в состав липопротеиновой оболочки вируса, однако, пространственно выступают на поверхности со­б­ран­ной вирусной частицы.

При обработке очищенного вирусного препарата трипсином или детергентами белок Е ВКЭ легко отщепляется от поверхности вириона в растворимом состоянии. Сохраняющаяся при этом ин­так­тная структура белковой глобулы была изучена рентгено­струк­тур­ным анализом [72]. На рис. 3 представлена схема прост­ранст­вен­ной конфигурации полипротеинов димера поверхностного белка Е ВКЭ. Из полученных данных следует, что на поверхности вируса бе­лок Е представляет собой отдельную объемную единицу, состоя­щую из комплекса двух молекул (димера) вирусного белка Е. При этом каждая молекула белка Е в димере представляет собой про­долговатое образование, состоящее из трех структурных клуб­ков-доменов (I–III), собранное определенным образом из единой полипептидной цепочки. Объемный каркас каждой мо­ле­ку­лы в ви­де трех структурных доменов белка Е жестко фиксиру­ет­ся шестью дисульфидными мостиками, образованными 12 цис­теино­выми остатками в полипептидной цепи белковой молекулы. Абсо­лютная консервативность цистеиновых остатков в составе белка Е и высокая гомологичность профиля гидрофиль­ности полипеп­тида этого белка для всех флавивирусов предполагают одинаковую пространственную структуру поверхностного белка Е флави­ви­ру­сов. Надмолекулярная димерная структура поверх­ност­ного бел­ка вируса дополнительно поддерживается межмолеку­ляр­ным взаимо­действием двух объемно протяженных молекул, стянутых вместе по принципу голова-хвост или валетом. В резуль­тате получается объ­емная симметричная структура димера с общими размерами длиной 150Е, шириной 55Е и толщиной 30Е, где боковые по­верх­ности в основном формируются I и II парными доменами, а торцевые поверхности — доменами III и частично I двух, обра­зую­щих белковый димер, молекул. Плоская структура димера располагается параллельно с поверхностью липидной бислойной мембраны вириона, и в результате, как считается, белок Е обра­зует на поверхности вируса объемно-решетчатую сеть толщиной 30Е.

Результаты рентгеноструктурного анализа подтверждаются дан­ными визуализации вирионов флавивирусов методом элект­рон­ной микроскопии. Выступающие на поверхности вириона сво­бодные участки димера белка Е, состоящие из двух димеро­обра­зую­щих парных доменов I, II и дистальных доменов III, свя­зы­вают нейтрализующие вирус иммунопротективные антитела. Не удивительно, что мутации, расположенные на поверхности ди­ме­ра, как будет рассмотрено ниже, могут иметь серьезные послед­ствия в патогенезе инфекции.

С использованием набора моноклональных антител (МКА) изучены иммунохимические свойства и проведено картирование антигенных детерминант на димере белка Е. На рис. 3 показаны то­пологические связи, серологическая специфичность и функции отдельных эпитопов, представляемых различными клонами МКА против белка Е штамма Найдорф западного серотипа ВКЭ [15].

На основании метода конкурентного связывания МКА были определены три неперекрывающиеся антигенные домена А, В и С, каждый из которых состоит из нескольких эпитопов А1–А5, В1–В5 и С1–С6, которые проявляют различные функции и се­ро­ло­гическую специфичность. Более того, МКА выявили три изоли­рованных эпитопа вне антигенных доменов i1–i3. Домен А содер­жит не только перекрестно реагирующие между различ­ны­ми фла­вивирусами эпитопы А1 и А2, но также специфические к субтипам ВКЭ эпитопы А3 и А4. Большинство эпитопов анти­ген­ного домена В специфичны к вирусам комплекса клещевого энцефалита, тогда как домен С преимущественно содержит специ­фические к ви­рус­ным субтипам эпитопы. Вируснейтрализующую активность проя­ви­ли МКА, соответствующие эпитопам А3, А4, А5, В1, В2, В4, В5, С1 и i2. Примечательно, что эпитопы внутри каждого анти­ген­ного домена показывали одинаковые структурные свойства: чув­ствительность к денатурации при низких рН, про­теолизу и вос­становлению дисульфидной связи. Это, несомненно, подт­вер­ж­дает, что антигенные домены соответствуют хорошо известным стуктурным доменам белка Е.

Семь из вышеназванных эпитопов, в которых точечные му­та­ции за­­мещения аминокислотных остатков ведут к потере нейт­ра­­лизации вируса соответствующими МКА (escape mutations), со­­средоточены в двух больших не перекрывающихся участках, ан­тигенных доменах С и А, соответствующих пространственным доменам I и II белка Е. Антигенные домены разобщены не только пространственно, но и отличаются по их чувствительности к кон­­­формационным изменениям и фрагментации. Оба антигенно реактивных участка вовлекаются в реакции нейтрализации вируса, но домен А содержит так называемые конформационные антигены, тогда как домен В — антигены, резистентные к конформационным изменениям и денатурации. Антигенный домен В, соответ­ствую­щий структурному домену III белка Е, представляет собой доста­точ­но автономное образование. Он может быть отщеплен от осталь­ной части белковой молекулы трипсиновой обработкой на­тив­ного вириона или синтезирован отдельно, как генно-инже­нерный продукт, экспрессией рекомбинантной ДНК. Однако, в обоих случаях ведущая к нейтрализации вируса иммуно­хи­ми­чес­кая актив­ность антигенного домена В реализуется только при сохранности дисульфидного мостика внутри соответствующего структурного домена III белка Е. Как предполагается авторами, не исключено, что представленные отдельные эпитопы МКА со­с­тав­ляют только части центров связывания нейтрализующих ан­ти­тел, составлен­ных из фрагментов различных субъединиц белка на нативной структуре поверхности вириона. Хотя отсут­ст­вует спе­циальное подтверждение, но часть центров нейтрали­за­ции ви­руса на белке Е, возможно, потеряна при получении со­люби­ли­зи­рованного димера.

Локализация антигенных доменов на полипептидной карте белка Е показала, что структурный домен I образован N-конце­выми 50 а.о. полипептида вместе с фрагментом 125–200 а.о., со­­держащим сайт гликозилирования белка Е, и другим фрагментом 250–300 а.о. Внутренние фрагменты полипептида 50–125 и
200–250 а.о. образуют домен II белка Е. Следующие около 100 (301–395) а.о. полипептида белка Е составляют структурный до­мен III. Последние 50 а.о. с самого С-конца полипептида со­с­тав­ляют якорную цепочку белка Е в бислойной липидной мемб­ра­не вириона.

Белок Е штамма Софьин дальневосточного генотипа и серо­типа ВКЭ, по данным работы [16], образует также три функцио­нально гетерогенных антигенных домена Е1–Е3. Еще два изо­ли­ро­ванных эпитопа не входят в домены Е1–Е3. Эпитопная карта бел­ка Е ВКЭ штамма Минск-256 (европейский генотип) содержит два основных домена Е1, Е2, и два эпитопа изо­лированы от остальных. Наибольшее отличие состоит в том, что домены Е1 и Е2 перекрываются через МКА 2Н3 и 13D6, а также наблюдаются «перестановки» эпитопов 1А2 и 1Н11, 14D5 и 13D6 в доменах Е1 и Е2, соответственно. Домен Е3 и изоли­ро­ван­ные эпитопы остаются без изменений. У штамма Софьин эпито­пы, участвующие в нейтрализации вируса, в доменах Е1 и Е2, соответственно, образуют один основной сайт. По модели Heinz у вируса штамма Найдорф все три основных домена содержат нейт­рализующие эпи­топы. У штамма Софьин основные эпитопы нейтрализации вируса расположены в районе 375–471 а.о. линей­ной карты белка Е. В этом районе белка Е локализованы домены нейтрализации и других флавивирусов: вируса японского энцефа­ли­та (303–396 а.о.), вируса энцефалита долины Мюррей (390 а.о.), вируса ли­хорадки Денге (280–414 а.о.).

Таким образом, эпитопное картирование белка Е различных штаммов ВКЭ при помощи различных авторских серий МКА к этому белку, в общем случае, согласуется с выше обсуждавшимися результатами структурных исследований димерного комплекса этого белка штамма Найдорф, с трехдоменным объемным пред­став­лением о нем. Идентификация иммуноактивных участков бел­­ка Е ВКЭ штамма Софьин с помощью его синтетических пептид­ных фрагментов показала [47, 48]: антитела к пептидным фрагментам белка Е в поз.98–113 и 394–403 а.о. являются вирус­нейтрализующими; пептид, соответствующий а.о. белка Е
35–51, является частью конформационно зависимого В-эпитопа белка Е; в ряду потенциальных Т-эпитопов выявлены пептиды 48–74, 90–113, 204–224, 275–302 и 377–403, иммуногенные в свободном виде без коньюгации с белком-носителем и содержащие Т-хел­пер­ные эпитопы; пептиды 204–224, 275–302 и 377–403 способны эффективно связываться с противовирусной сывороткой человека и входят в состав В-эпитопов вируса; по ингибированию слияния вируса с макрофагами, липосомами и с применением МКА уста­нов­лено, что полипептидный фрагмент белка Е
98–113 является участ­ком слияния ВКЭ с эндосомальной мемб­ра­ной клетки-хозяи­на. По мнению авторов работы [15], полипеп­тид­ный фрагмент 398–413 а.о. белка Е ВКЭ, вирусов Западного Нила, DEN-2 и желтой лихорадки по характерному профилю своей гидрофобности соответствует иммунодоминантному Т-кле­­точ­ному сайту. Таким образом, белок Е флавивирусов по сво­им структурно-функцио­нальным свойствам определяет не только тро­пизм вируса, но также играет, по-видимому, во многом ключевую роль в вирулентности вируса, развитии гуморального и клеточного иммунитета.

4.4. Репликативный цикл флавивирусов

ВКЭ характеризуется широким клеточным тропизмом и мо­жет размножаться in vitro во многих клеточных линиях мле­ко­пи­тающих, членистоногих и птиц. Однако, не только у ВКЭ, но так­же у всех флавивирусов связывание вируса с поверхностью пермиссивных клеток и начальные события вирус-клеточного взаи­модействия до сих пор детально не изучены. При помощи ан­тиидиотипических антител, имитирующих гемагглюти­нирую­щие эпитопы белка Е, показано, что в качестве специфических рецепторов ВКЭ на поверхности клеток может выступить лами­ниновый рецептор человека [57]. Также предполагается, что в организме сорбция и дальнейшее необратимое связывание вириона с клеткой может быть опосредовано С3 компонентом компле­мен­та, Fc детерминантой иммуноглобулинов или с участием специ­фических антител, когда уровни их концентрации ниже, чем ней­трализующие титры [40]. После прикрепления к клеточной по­­верхности вирионы флавивирусов локализуются во впячивани­ях клеточной мембраны, где они подвергаются эндоцитозу с об­ра­зованием эндоцитозных везикул (пузырьков). Иногда может наблю­даться и прямое слияние мембран. Детальные механизмы процессов раздевания вируса, трансляции внедренной в клетку ви­русной РНК в вирусный полипротеин с процессингом протеазами в структурные и неструктурные вирусные белки, репликации ви­русной геномной РНК, сборки нового нуклеокапсида и формиро­вания зрелого, инфекционного вириона с участием клеточных компонентов и структур пока не исследованы.

Предполагаемая схема внутриклеточного жизненного цикла флавивирусов представлена на рис. 4 [41]. После стадий связы­ва­­ния с клеткой, эндоцитоза вирионов, слияния и расплавления мембран происходит раздевание нуклеокапсида и освобождение геномной РНК в цитоплазме. Далее следуют сложные совмещенные стадии трансляции и процессинга полипротеина (синтеза струк­тур­ных и неструктурных вирусных белков) с ассоцииро­ван­ной с мем­браной репликацией — размножением (+)- и (–)-це­пей новой вирусной РНК. Затем вновь синтезированная (+)-цепь вирусной РНК комплексуется с preM, M и С-белками в вирусный нук­лео­капсид. Дальнейшая сборка вириона с участием поверхностного Е белка и созревание полного инфекционного ви­руса происходят в клеточных структурах и окончательно завер­ша­ются в процессе транспортировки вирусов через клеточную мем­б­рану. Вирионы созревают по мере передвижения из шеро­ховатого эндоплаз­мати­чес­кого ретикулума в гладкий, затем в аппарат Гольджи и, нако­нец, в плазматическую мембрану клетки.

Созревание вируса с повышением его инфекционной актив­ности также связывают с делеционным расщеплением preM белка с образованием структурного белка М зрелого вириона ВКЭ. Это расщепление встречается перед самым высвобождением вириона из клетки или одновременно с процессом транспортировки вириона через клеточную мембрану (Рис. 5). Как предполагается, антитела к preM белку могут способствовать протективному иммунитету путем нейтрализации содержащих preM-антиген вирионов, на­хо­дящихся на клеточной поверхности.

При инфицировании флавивирусами некоторых линий клеток позвоночных наблюдается образование дефектных вирусных частиц с неполным геномом или с нарушенным порядком распо­ло­жения генов в геномной РНК, так называемых дефектных ин­тер­ферирующих вирусных частиц, секретируемых в возрас­таю­щих концентрациях с ростом числа пассажей. Синтез интерфе­ри­рующих частиц характерен для персистентной хронической инфекции. Как было показано, у мышиной линии, резистентной к флавивирусной инфекции, это свойство придается наличием оди­ночного аутосомально-доминантного локуса в геноме, назван­ного Flv и картированного на пятой хромосоме [40,74]. В инфи­ци­рованной культуре первичных фибробластов от резистентной мыши синтез вирусной РНК ограничен, титр ин­фек­ционного ви­ру­са низок, а доля дефектных интерферирующих частиц значи­тельна в результате только одного пассажа. Флави­ви­русы могут реплицироваться в организме резистентной мыши, но развитие инфекции замедлено, максимальная виремия на 3–4 порядка ниже, чем у нормальной мыши [41]. Эти эксперименты показали, что до сих пор не идентифицированный специфический хозяйский ген может драматически влиять на синтез флавиви­рус­ной РНК, на характер репликации вируса в клетке. Однако, в какой степени аналогичный механизм подавления реплика­тив­ной инфекции может реализоваться в частном случае широко распространенного персистентного клещевого энцефалита у человека, пока не иссле­довано.

Новая информация, расскрывающая связь между механиз­мом репликации вируса в инфицированной клетке и патогенезом инфекции клещевого энцефалита получена Морозовой О.В. в ре­зуль­тате изучения репликативного комплекса ВКЭ с участием кле­точных и вирусных неструктурных белков NS5, NS3 и ви­рус­ной РНК. На основании полученных результатов предпола­га­ется, что РНК-зависимый синтез может регулироваться при помо­щи изменения состава внутриклеточного комплекса вирусных и клеточных белков. Выход белка NS5 из состава комплекса при­во­дит к нормальному переключению синтеза с «минус»-цепей РНК на геномные РНК и, следовательно, к развитию репликатив­ной инфекции. Уменьшение относительных количеств белка NS3 в составе ассоциированного с мембранами комплекса вирусных белков, возможно, ингибирует скорость синтеза геномных РНК, что приводит к реализации процесса медленной персистентной инфекции [76].

Клетки, инфицированные флавивирусами, кроме зрелых и де­­фектных вирусных частиц также секретируют медленно седи­мен­тирующие частицы с внешним размером 14 нм, состоящие из корпускулярных агрегатов Е и М белков вируса. Как показано, эти неинфекционные частицы вирусного происхождения являются эффективными иммуногенами в синтезе антител с нейтрали­зую­щими вирус, протективными свойствами.

В инфицированных флавивирусами клетках происходят хоро­шо заметные ультраструктурные изменения, включая вакуоли­за­цию, пролиферацию внутриклеточных мембран. Инфекция часто цитоцидна, хотя часть клеток сохраняется и, таким образом, ста­­новится хронически инфицированной. Даже на стадии мак­си­мальной репликации вируса значительного ингибирования син­теза клеточных макромолекул не наблюдается.

Кроме человека, ВКЭ также высокопатогенен для обезьян и белых мышей. Малочувствительны к нему кролики, морские свин­ки. В экспериментальной инфекции наряду с высокочувстви­тель­ной и низкочувствительной моделями белой мыши и морской свин­ки промежуточную позицию по чувствительности к развитию нейропатологии клещевого энцефалита занимают сирийские хо­мячки. Из домашних животных к инфекции клещевого энцефа­ли­та восприимчивы поросята и овцы. Козы и коровы также инфи­ци­ируются ВКЭ, однако инфекция часто ограничивается кратко­временной вирусемией с проникновением вируса в молоко живот­ных [2, 3, 41]. В результате нападения клещей в организме теп­­­­ло­кровных животных развиваются специфические защитные реакции и при повторном присасывании клещей к иммунным жи­­вотным у паразитов могут резко нарушаться процессы насы­ще­ния и наступить их гибель [53].

5. Молекулярно-генетическая неоднородность и патогенность вируса клещевого энцефалита

5.1. Генотипы и серотипы вируса

По результатам РТГА антигенные группы флавивирусов были разделены на 8 родственных комплексов или групп. Вне этих групп также к флавивирусам относится вирус желтой лихорадки. В первый из комплексов — антигенный комплекс вирусов кле­ще­­вого энцефалита — входят: вирусы клещевого энцефалита, ом­ской ге­моррагической лихорадки, кьясанурской лесной болезни, Louping ill (шотландского энцефаломиелита овец), Лангат, По­вас­сан, Не­ги­ши, Карши и Royal Farm [41]. По результатам ге­но­типи­ро­ва­ния штаммов ВКЭ штамм Вергина, считавшийся од­ним из штам­мов ВКЭ, кластеризуется с вирусами комплекса клещевого энце­фа­­лита греческого и турецкого энцефаломиелита овец и, по-види­мо­му, не является собственно вирусом клещевого энцефалита [78].

В ряде первых работ уровень гомологии и генетические взаи­моотно­ше­ния штаммов ВКЭ изучались методом генотипирования с при­ме­нением двух типов зондов: кДНК-зонда, представляющего собой комплементарные копии трех фрагментов геномной РНК ВКЭ штамма Софьин в составе рекомбинантных плазмид, сум­мар­но пре­крывающих около половины вирусного генома со сто­ро­ны 5’-конца, а также синтетических олигонуклеотидных
ДНК-зон­­­дов длиной 18–26 нуклеотидов, комплементарных раз­лич­ным учас­ткам РНК ВКЭ. Кроме того, использовали два олиго­нук­­леотидных зонда, специфичных для западного штамма Най­дорф. На основании способности РНК 143-х штаммов ВКЭ гибри­ди­зо­вать­ся с перечисленными зондами был разработан критерий отне­се­ния каждого штамма вируса к одному из шести условно вы­де­лен­ных генетических вариантов вируса.

Генетическую вариабельность природных популяций ВКЭ изучали с помощью коллекции из 200 штаммов, изолированных из различных эндемичных районов бывшего Советского Союза — от Приморья на востоке до Западной Украины и Калинин­град­­ской области на западе, Крыма и Киргизии на юге. Оказалось, что установленные методом молекулярной эпидемиологии с при­менением ДНК-зондов те или иные варианты вируса циркулируют на разных, иногда весьма отдаленных друг от друга территориях или имеют смешанные сов­местные места распространения. Было показано, что штаммы, по­добные прототипному штамму Софьин дальневосточного подти­па, составляли всего 16 % изученной кол­­лекции и встречались преимущественно на Дальнем Востоке, реже — в западной части об­следованного ареала и совсем редко — в Сибири и на Урале. Так­же выявлено, что штаммы, обладаю­щие некоторыми геном­ными последовательностями, характерными для европейского штамма Найдорф, распространены на восток, по крайней мере, до территории Западной Сибири [9–13,
24, 52].

В другой работе Злобин В.И. с соавторами для генотипи­ро­ва­ния ВКЭ получали кДНК-копии фрагмента гена Е длиной 160 нук­лео­ти­дов, используя ПЦР с необходимыми специфи­чес­ки­ми прай­ме­рами. Полученные фрагменты секвенировали и оце­ни­вали уровни гомологии. При различиях нуклеотидных последо­ва­­тель­ностей меж­ду двумя штаммами в 12% и более их относили к двум раз­­­ным генотипам. Анализ гомологии фрагмента гена Е 35 штам­­­мов ВКЭ, изолированных в различных участках ареала, по­­ка­зал, что они могут быть разделены также на 6 геноти-пов [56].

В опубликованных позже работах Xeinz с соавторами ге­но­ти­пирование ВКЭ было проведено анализом нуклеотидных после­до­вательностей полного гена белка Е из 1488 нуклеотидов и пол­ных ами­­но­кислотных последовательностей белка Е 25 штам­мов ВКЭ, изолированных по всей территории распространения клещевого энцефалита в Европе и Азии [43]. Были синтезированы под­хо­дя­щие полимеразные праймеры для амплификации гена белка Е. Амплифицированные с применением ПЦР гены Е ВКЭ всех 25 штаммов были секвенированы. Список штаммов ВКЭ, изученных путем анализа первичной нуклеотидной последова­тельности гена и сопоставления нуклеотидной и соот­вет­ствующей аминокислотной последовательностей белка Е каж­дого штамма, приводится в табл. 1. Данные по нуклеотид­ной по­­сле­дова­тельнос­ти гена Е части штаммов ВКЭ были взяты из опубликованных работ других авторов. Географическое место­по­ложение каждого выделенного изолята ВКЭ на евразийском кон­ти­ненте указано на ранее представленной карте (рис. 1). В резуль­тате филогене­ти­­ческого анализа нуклеотидных и амино­кис­лотных последова­тель­ностей вирусного белка Е авторами выявлены всего 3 генети­чес­кие линии штаммов, соответствующие европейскому, дальне­восточному и сибирскому субтипам ВКЭ. Филогенетическое древо происхождения вирусов трех субтипов ВКЭ иллюстрируется на рис. 6. Как установлено, степень вариации в составе амино­кис­лотных остатков белка в пределах одного субтипа вируса незна­чи­тельна и колеблется в пределах всего 2,2%. Максималь­ная сте­пень расхождения в составе аминокис­лотных остатков белка Е между субтипами вируса достигает 5,6%, что находится в пре­­делах колебаний этой характеристики, соответствующей разнице между различными флавивирусами. На этом основании считается оправданным выделение ВКЭ в качестве самостоя­тель­ного представителя флавивирусов с тремя субтипами: европейский субтип ВКЭ с прототипным штаммом Найдорф, включающий дру­гие штаммы этого вируса из Австрии, Швей­ца­рии, Франции, Германии, Венгрии, Чехии, Словении, Хорватии, Финляндии, Белоруссии и Европейской части России; дальневос­точный субтип ВКЭ с прототипным дальневосточным штаммом Софьин, вклю­чаю­щий другие штаммы этого вируса из Дальнего Востока, Китая, Японии и также некоторые штаммы ВКЭ из Лат­вии, Украины и западной части России; сибирский субтип ВКЭ с прототипным штам­­мом Айна, включающий штамм Ва­сильченко и другие мно­го­численные восточно- и западносибирские штаммы вируса [45]. Как подчерк­ну­то авторами работы [43], у белка Е ВКЭ сте­пень вариабельности аминокислотного состава (0–5,6%) зна­чи­тельно ниже величины вариации нуклеотидного состава (1–16,9%) в пер­вичной после­до­вательности его гена, и селек­ци­онный пресс эволюции вируса более однозначно фиксируется в аминокислотном составе белковой молекулы вируса. Поэтому в аминокислотной по­следовательности белковой молекулы легче могут быть выде­ле­­ны генотипически характеристические фраг­мен­ты последова­тель­ности остатков ами­но­кислот. Например, в поз. 206 аминокис­лотной последова­тель­нос­ти белка Е все три ге­но­типа вируса пред­ставлены тремя раз­лич­ными неповторяющи­мися аминокислот­ными остатками, уни­каль­ными для каждого субтипа вируса: для ев­ропейского — Val, для сибирского — Leu и для дальневосточного суб­типа ВКЭ — Ser. В результате, по мне­нию авторов [43], на ос­­нове иденти­фи­ка­ции аминокислотного остатка в поз. 206 и час­­ти других ха­рак­теристических остатков белковой молекулы суб­тип каждого нового изолята ВКЭ из трех выявленных гено­ти­­пов вируса в на­стоящее время может быть расшифрован не обя­­зательно пол­ным, а только частичным секве­ни­рованием ге-­на Е, его фрагментов, соответствующих характерным участкам белка Е.

Согласно недавним публикациям Злобина В.И. с соавторами, эти З субтипа ВКЭ могут быть установлены также на основе ана­лиза первичной структуры или уровней гомологии фрагмента ге­на белка Е [77, 78]. Генотипирование ВКЭ с получением ана­ло­­­гичных результатов может быть проведено и методом гибриди­зации нуклеиновых кислот с применением молекулярных зондов, составленных из олигонуклеотидов длиной 18–22 оснований, ком­плементарных фрагментам РНК, кодирующим белок Е про­то­тип­ных штаммов ВКЭ [79]. При этом штаммы ВКЭ, от­не­сен­ные в выше цитированных ранних работах Злобина В.И. с соавто­ра­ми к генотипам 4 и 5 на основании степени их отличий в го­мо­ло­гии нуклеотидных последовательностей от штаммов гено­типа 1, 2 и 3, в результате сравнения выведенных соответст­вую­щих ами­нокислотных последовательностей фрагмента белка Е в новых работах этих авторов отнесены к генотипам 2 и 3. Штамм Вер­ги­на, ранее отнесенный генотипу 6, примыкает к вирусам ту­рец­кого энцефаломиелита овец, греческого энцефаломиелита коз и, по-видимому, является не вирусом клещевого энцефалита, а отно­сится к вирусам антигенного комплекса клещевого энце­фа­лита.

Насколько полно установленные в настоящее время три суб­ти­па ВКЭ — европейский, дальневосточный и сибирский — пред­ставляют все разнообразие природных штаммов вируса, по-види­мо­му, будет показано при дальнейшем изучении новых штам­мов ви­руса. Изоляты вируса с новых мест и территорий, охватываю­щих более полно огромный ареал распространения вируса, будут отражать в своем геноме более адекватно все разнообразие условий циркуляции вируса в природе.

Филогенетическое древо, или родословная ВКЭ, построенное авторами работ [43, 46], исходя из последовательности полного гена вирусного белка Е, состоит из трех ветвей, что отражает су­­­­ществование трех репродуктивно изолированных субтипов вируса, первоначально происходящих от одного предшественника. Предполагается, что первичным ареалом становления ВКЭ яв­лял­ся Дальний Восток России, и отсюда вирус эволюционировал и распространялся в северном полушарии Земли с востока на за­пад. Это заключение расходится с ранее выдвинутой гипотезой, согласно которой через восточноазиатское и индоазиатские миг­рационные русла на востоке и восточноевропейские — на западе на территории ареалов I. persulcatus и I. ricinus во время весенней миграции птиц систематически заносились вирусы, некоторые из которых могли адаптироваться к этим видам клещей. В резуль­тате дальнейшей эволюции из двух центров и могла сформиро­вать­ся генетически устойчивая двухвидовая популяция ВКЭ [81].

Эволюция — процесс постепенный, непрерывный и очень дли­тель­ный. Исходя из средней частоты нуклеотидных замещений в генах изученных штаммов вируса, изолированных в разное вре­мя, и зная синономические дистанции филогении нуклео­тид­ных последовательностей вируса, удается оценить общее время ста­новления флавивирусов из группы антигенного комплекса клещевого энцефалита. По этим данным ВКЭ эволюционирует в те­чение нескольких тысяч лет и достиг Западной Европы
1–2 тыс. лет назад. Дивергенция дальневосточного и сибирского субтипов вируса произошла 1700–2000 лет назад. А отдельный япон­ский клещевой пул вируса на юге острова Хоккайдо со штам­мом Oshima, по мнению авторов, происходит из Дальнего Вос­то­ка и образует новый эндемичный район распространения клеще­вого энцефалита в течение последних 260–430 лет [46].

По данным этих работ средняя частота нуклеотидных заме­ще­ний в структурных генах ВКЭ достаточно высока и равняется 2,90´10–4заменам на один сайт в течение года. Однако, она значительно ниже, чем у других распространенных РНК вирусов, например, ВИЧ и ВГС, где час­то­та замещений составляет 1,310´10–2и 1,308´10–2замен на один нуклеотидный сайт в год, соответственно. Предполагается, что это как-то связано с двой­ной природой клеток хозяев-но­си­телей и животных-про­кор­ми­телей клещей у ВКЭ — членисто­но­гих и позвоночных.

Территориальные антигенные серотипы ВКЭ и их известные, наиболее характерные прототипные штаммы на территории России и в Европе были ранее выявлены серологическими методами в течение длительного времени с учетом существенных антигенных отличий от известных серотипов, широты ареала, их роли в эти­ологии манифестных форм заболевания (острых, хронических) и влияния штаммов на формирование популяционного иммуни­тета. Считается, что на территории России к настоящему времени обнаружено пять антигенных вариантов (подтипов) ВКЭ: даль­невосточный; западный (центрально-европейский); Вергина; вос­точносибирский; урало-сибирский. По мнению авторов [52], исходя из результатов разных работ, полученных с помощью раз­­­личных методов и реагентов, включая моноклональные анти­тела, позволяющих фиксировать внутривидовые антигенные ва­риации ВКЭ, можно сделать вывод, что те или иные серо­ва­ри­ан­ты вируса циркулируют на разных, иногда весьма удаленных друг от друга территориях или имеют совместные места обитания. В частности, показано, что штаммы, относящиеся к дальневос­точ­­ному антигенному варианту, встречаются также в Восточной и Западной Сибири, на Урале и даже на самой западной российс­кой территории — в Калининградской области. В то же время в Вос­точной и Западной Сибири обнаружены дальневосточный, восточносибирский и урало-сибирский варианты, на Урале — даль­невосточный и урало-сибирский, в Центральном районе ев­ро­пейской России описано выделение штаммов, принадлежащих к вариантам Вергина и западному. Как подчеркивается авторами [52], по-видимому, очень сложно адекватно оценить и свести в еди­ное целое результаты многочисленных работ, посвященных антигенной вариабельности ВКЭ, и тем более попытаться нарисо­вать картину географического распространения антигенных субти­пов (серотипов) в пределах его ареала в силу разнородности мето­дических подходов и оценочных критериев разных исследователей. Как представляется В.И. Злобину и О.З. Горину, для характе­рис­­­­ти­ки генетической вариабельности вируса больше подходит срав­нение уровней гомологии геномов различных изолятов. Оче­видно, это так, однако, как видно из изложенного выше, разно­чте­ния вначале были возможны и в установлении генотипов вируса методами секвенирования гена белка Е ВКЭ или молекулярной гибридизации фрагментов кДНК с РНК ВКЭ.

Исторически получилось так, что лабораторная иденти­фи­ка­ция антигенной неоднородности, и тем самым соответствующей генетической гетерогенности штаммов ВКЭ, проводилась сероло­гическими методами наравне с изучением клинических проявлений клещевого энцефалита в регионах. Например, штамм Айна/1448 (Айна) восточносибирского антигенного подтипа ВКЭ впервые был выделен в 1963 г. из ликвора больной клещевым энцефали­том 11-летней девочки по имени Айна, жительницы ле­состепной зоны Иркутской области. Предполагался алимен­тар­­ный путь зара­жения через сырое коровье молоко. Заболевание началось внезап­но с головной боли с температурой 39°С и с но­со­вым кровотече­нием. Через 3 недели развился парез правой руки и ноги. Позже в клинике нервных болезней г. Иркутска диаг­нос­­тирована кожев­ни­ковская эпилепсия. На 131-й день болезни в крови больной вы­явлены антитела к аутоштамму при отрица­тель­ной реакции с ан­ти­телами к ВКЭ штамма Софьин. Последую­щее изучение анти­генной структуры штамма Айна с использо­ванием методов РДПА и принципа перекрестной дозированной адсорбции сывороток позволило выявить серологическое отличие этого штамма вируса не только от штамма Софьин дальневосточного, но и от штамма Най­­дорф западного серотипа ВКЭ и оценить его как самостоя­тельный сибирский (восточносибирский) серотип ВКЭ [14].

Установлено, что сибирский серотип ВКЭ с прототипным штам­­­мом Айна включает многочисленные близкородственные штаммы этого вируса, выделенные из различных источников на территории Иркутской, Читинской, Курганской и других об­лас­тей, Красноярского и Приморского краев, республики Бурятия. Из 47 изученных иркутских штаммов 31 штамм включен в серо­тип ВКЭ с прототипным штаммом Айна; они составляют однотип­ную по антигенным свойствам группу с небольшими количествен­ными вариациями. Из них 7 штаммов выделены из мозга грызу­нов; 15 штаммов — из клещей I. persulcatus, по одному штамму — из клещей D. nuttalli и из мозга утки-широконоски, 5 штаммов — от больных хроническими формами клещевого энцефалита и дру­гими хроническими заболеваниями ЦНС, один штамм — из мозга человека, погибшего при остром клещевом энцефалите.

Связь вируса этого серотипа с этиологией острых и хрони­чес­ких форм клещевого энцефалита подтверждена многими клини­чес­кими иммунологическими работами. В группе больных кле­ще­вым энцефалитом из Иркутской области сыворотки, избира­тель­но реагирующие только со штаммом Айна, выявляются досто­верно чаще (36,8%), чем в целом в популяции (16,6%) [14]. При обследовании больного хроническим клещевым энцефалитом из Красноярского края через 4 и 5 лет от начала заболевания вы­­­явлены антигемагглютинины только к штамму Айна в титре 1:20–1:40 при отрицательных результатах реакции с антигенами штаммов 256 (западный штамм, выделенный в Белоруссии) и Софьин (рис. 7). С терапевтическими целями больному была вве­­­­дена инактивированная вакцина клещевого энцефалита из штамма Софьин. Вторичный иммунный ответ характеризовался появлением антигемагглютининов к восточному и к западному серо­­типам ВКЭ при одновременном резком подъеме титра антител к штамму Айна до 1:320. Данный пример наглядно показывает, что штамм серотипа Айна причастен к этиологии хронического кле­­щевого энцефалита у этого больного, антигены восточного, си­­­бирского и западного серотипов ВКЭ отличаются серологически. Однако, при введении вакцины лицу, имеющему грундиммунитет, индуцированный инфекцией клещевого энцефалита штаммом-возбудителем серотипа Айна, вторичный иммунный ответ имеет более широкий поликлональный, полиштаммовый характер.

В структуре иммунитета к серотипам ВКЭ у здорового серо­по­­­зитивного населения ряда сибирских регионов вируснейт­ра­лизующие антитела к штаммам Айна+Софьин, только к штамму Айна и только к штамму Софьин составляют в %: в Иркутской об­ласти 46,8, 34,0 и 19,2; в Читинской области 37,5, 37,5 и 25,0 и в Красноярском крае 63,0, 12,0 и 27,0, соответственно. Та­ким образом, результаты распределения противовирусных анти­тел у больных клещевым энцефалитом и у здорового населения Си­бири выявили участие штамма ВКЭ Айна в формировании гумо­рального иммунитета у населения целого региона [14]. По результатам молекулярно-генетических исследований штамм Айна отнесен к широко распространенному сибирскому субтипу 3 ВКЭ и признан его прототипным штаммом [43, 77, 78].

Таким образом, генетипические особенности ВКЭ находят от­ра­жение в результатах серотипирования возбудителя и серо­эпи­демиологических исследований ВКЭ-инфекции в эндемичных регионах. При этом следует отметить, что не наблюдается прямой связи между распределением генотипов ВКЭ и распределением видовых различий их носителей — иксодовых клещей по регионам распространения инфекции. Безусловно представляет интерес про­вести сопоставление особенностей клинической картины кле­ще­вого энцефалита по регионам распространения природно-очаговой инфекции с преимущественной циркуляцией отдельных генотипов (серотипов) вируса и видовыми различиями иксодовых клещей.

5.2. Клинические особенности клещевого энцефалита по регионам распространения

В недавней работе [44] авторы изучали особенности кли­ни­чес­ких проявлений клещевого энцефалита в эндемичных гео­гра­фи­ческих регионах с циркуляцией различных генотипов и серо­ти­пов возбудителя. Сравнительный анализ заболеваемости, кли­ни­ческой картины, характера течения и исходов клещевого энце­фа­лита проведен на основе статистических данных и данных лите­ра­туры в Северо-западном регионе (Ленинградская область), в Хабаровском и Приморском краях Дальнего Востока и в При­ан­­гарье. По результатам гено- и серотипирования характерным генетическим вариантом ВКЭ в Северо-западном регионе в большей степени является западный генотип с прототипным штаммом Найдорф, на Дальнем Востоке — дальневосточный генотип, штамм Софьин, в Приангарье — сибирский генотип, штамм Айна [24, 43]. Сравнительная характеристика клинико-эпидемио­ло­ги­­­ческих показателей клещевого энцефалита в изученных регио­нах дана в табл. 2.

Прежде всего, различия в клинических показателях инфек­ции по регионам, если они есть, то носят, так сказать, количест­вен­ный, а не качественный характер и не выходят за пределы вари­антов единой нозологической формы.В продолжительности ин­кубационного периода в трех ис­сле­­дованных географических регионах существенных различий не установлено. Острое начало забо­левания более характерно для дальневосточного региона. Не­смотря на более выраженную тяжесть течения, заболевание на Дальнем Востоке характе­ри­зуется меньшим по длительности лихо­радочным периодом, чем в Приангарье: в среднем, 7,2 дня против 11,7 дня, соответственно.

Основные различия в проявлении клещевого энцефалита в ре­гионах связаны с выраженностью вовлечения в патологический процесс центральной и периферической нервной системы, что от­четливо прослеживается при анализе показателей клинических форм заболевания в регионах. Так, в остром периоде болезни на­ру­­шение сознания в виде различной степени оглушенности и комы выявлено в Приморском крае у 62,3 % больных, в Хаба­ров­­ском — у 43,8% пациентов, а в регионах, характерных по цир­­куляции сибирского генотипа ВКЭ, значительно реже — всего у 4,7% заболевших.

Заболевание, вызываемое сибирским генотипом вируса, чаще всего проявлялось в виде лихорадочных и менингеальных форм (86,5%). В Приморском крае, где характерно распространение даль­невосточного генотипа вируса, чаще других форм регист­ри­ро­валась менингоэнцефалитическая (35,9–39,3%), реже — менин­геальная (26,2%) и лихорадочная (14,0–15,6%).

Основным показателем поражения инфекцией мозга и его струк­тур является частота манифестации очаговых форм заболе­ва­ния. Очаговые поражения мозга на Дальнем Востоке представ­ля­ют собой классическую форму клещевого энцефалита, что и яв­ляется отражением особой тяжести его течения в ука­зан­ном регио­не. Частота проявления очаговых форм в Хабаровском крае составляет 30,9–54,3%, в Приморском крае — 60,1–63,5%, тогда как в Приангарье очаговые формы болезни регистрируются значи­тельно реже — в 13,5% случаев.

У подавляющего большинства больных на Дальнем Востоке на­­блюдается одноволновое развитие заболевания. Клещевой энцефалит с двухволновой лихорадкой в Приморском крае встре­чается в 3,4% случаев, в Хабаровском крае — у 6,0% забо­лев­ших, а в условиях Приангарья двухволновое течение клеще­вого энцефалита регистрируется с достоверно более высокой часто­той — около 21%.

В Приангарье заболевание в большинстве (75,2%) случаев име­ет среднетяжелое течение. Тяжелое течение отмечается у 16,7% больных, тогда как в дальневосточных районах тяжелая клиника наблюдается у 45,5–68,1% заболевших.

В условиях географической зоны с циркуляцией сибирского субтипа ВКЭ остаточные явления отмечены у 16,7% больных. Асте­новегетативный синдром наблюдался у 10,8% больных, парез лицевого нерва — у 0,5%, симптом свисающей головы — у 0,5%, сла­бость мышц шеи и верхних конечностей — у 0,7%, парез од­ной или двух верхних конечностей — у 1,7%, мышечные атро­фии плечевого пояса и верхних конечностей — у 2,9% больных. На Дальнем Востоке с циркуляцией восточного генотипа ВКЭ полное выздоровление наступает лишь у 25,5% пациентов, у 25,3% переболевших выявляется рассеянная симптоматика и у 22,1% — выраженные симптомы поражения головного и спинного мозга.

В Восточно-Сибирском регионе показатели летальности ха­рак­теризуются более низкими цифрами. Так, за последние
22 го­да летальность от клещевого энцефалита составила в среднем 2,45%, что достоверно ниже, чем на Дальнем Востоке, где она в отдельные годы колебалась от 8,6 до 44,7% и в среднем состав­ляет свыше 20%.

В Северо-Западном регионе в Ленинградской области среди нейроинфекций клещевой энцефалит занимает одно из первых мест. В 1951–1952 гг. в 78,6% случаев выявлялся алиментарный путь заражения через инфицированное молоко. В настоящее вре­мя, как и везде, преобладает трансмиссивный путь заражения при укусе клеща. В Северо-Западном регионе преобладает менин­ге­альная форма заболевания (57–60%) и регистрируется досто­верно чаще, чем в Восточно-Сибирском регионе (47,2%). Дос­товерно реже встречаются лихорадочные формы заболевания (18,4–27,4%) и достоверно чаще — очаговые формы клещевого энцефалита (19,2–29,3%). Частота клинических форм клещевого эн­цефалита с тяжелым течением в Северо-Западном регионе выше, чем в Восточно-Сибирском регионе. Клещевой энцефалит с двух­вол­новой лихорадкой более характерен для заболевания в Сибир­ском регионе, чем в Ленинградской области. Здесь следует отме­тить, что в более ранний период (50–70 гг. прошлого века), как вы­делено авто­ра­ми работы [53], «исключительно важным призна­ком двух­волнового менингоэнцефалита оказалась его четко выра­жен­ная территориальная локализация, охватывающая в СССР об­шир­ные районы Ленинградской области, всю территорию Удмур­т­ской АССР, отдельные районы Белоруссии, а за рубежом — от­дель­ные районы Словакии, Норвегию, Финляндию, Швецию».

Частота двухволновой лихорадки в очагах двухволнового ме­нин­гоэнцефалита в европейской части СССР в различные годы была равна 65–80% (в среднем 69,4%). Как видно из сопостав­ле­ния вышеприведенных данных, в последнее время в России на­блю­дается явное смещение регионов наи­большей распрост­ра­нен­ности двухволнового клещевого энцефалита с европейской час­ти в Сибирь.

При относительно благополучном развитии острого периода бо­лезни в Иркутской области чаще, чем в других регионах, ре­гист­рируются прогредиентное и хроническое течение клещевого энцефалита. В некоторых очагах клещевого энцефалита в районах верхнего течения Ангары и Лены, на севере Иркутской области, частота хронической инфекции доходила до 42–55% [52]. Из бо­­лее ранних источников известно, что если для патогенеза запад­ного варианта клещевого энцефалита специфично первичное пора­жение мезенхимальных клеток ЦНС, то для восточного типичны рез­ко выраженные альтеративные изменения с поражением мотор­ных нейронов [53].

За пределами Российской Федерации, например, в северо-вос­точных лесистых провинциях Китая вспышки клещевого энце­фалита протекают тяжело и по общей характеристике близ-ки кле­ще­вому энцефалиту на Дальнем Востоке России. В 1952–54 гг. у 83,2% больных развивались параличи, причем у 19,8% больных параличи локализовались в мышцах шеи и плечевого пояса. Летальность составляла 21,7% [1].

В странах Центральной Европы клещевой энцефалит проте­ка­ет менее остро, примерно как в западных регионах России, и имеет более выраженное двухфазное разви­тие [40]. Первая фаза инфекции начинается с лихорадки, как при гриппе, с повышением температуры до 38°С. Головная боль, недомогание, боли в мышцах появляются после инкубационного периода от 3 до 7 дней и про­­должаются около недели. Затем, после асимптоматического пе­риода продолжительностью до 7 дней, у 20–30% больных про­яв­ляются симптомы поражения ЦНС в форме асептических ме­нин­гитов, менингоэнцефалитов, менин­го­энцефаломиелитов или менингоэнцефалорадикулитов. Летальный исход наблюдается в 1–2% случаев, и инфекция у детей протекает легче, чем у взрос­лых. Менингеальная форма болезни, как прави­ло, завершается выздоровлением. Однако, у 10–20% больных с бо­лее тяжелыми кли­ническими проявлениями длительно сохра­ня­ются слабо выра­женные нейропсихические расстройства. Нару­ше­ния моторики редки.

По мнению авторов анализа клинических данных [44], уста­нов­ленные отличительные особенности проявлений клещевого энце­фалита в различных географически удаленных, эндемичных регионах можно связать с циркуляцией генетически различных по­пуляций ВКЭ на этих территориях. Однако, допущение прямой свя­зи отмеченных клинических особенностей инфекции с опре­де­ленным генотипом циркулирующего в регионе вируса является упрощенным представлением. Если не вызывает сомнения наличие существенных различий между проявленими инфекции в даль­не­восточном и западном или в дальневосточном и сибирском регио­нах, как это подчеркивается авторами, то трудно видеть разницу в клинической характеристике инфекции в регионах, где превали­руют западный или сибирский генотипы вируса, т.е. в европейской части страны и в Сибири. В этой связи А.П. Иерусалимский пи­­шет, что территориально Новосибирская область, располо­жен­ная на юге Западной Сибири, ближе находится к очагам заболе­ва­ния, протекающего по восточному нозогеографическому вариан­ту. Тем не менее, имеется больше оснований считать, что клещевой энцефалит в ней ближе западному варианту. В пользу этого гово­рят: отчетливое преобладание лихорадочных или менингеальных форм над менингоэнцефалитическими и, особенно, над полиоэнце­фалитическими и полиомиелитическими, значительный процент двух­волнового течения болезни, хорошие исходы заболева-ния [1]. С другой стороны, в отдельных эпидочагах инфекции внутри ре­гионов соотношения между различными клиническими формами инфекции (лихорадочная, менингеальная или очаговая) часто варь­и­руют в значительных пределах. О необходимости ос­торож­ной интерпретации связи между генотипом возбудителя и прояв­лениями инфекции, по-видимому, говорит так же и то, что за от­но­сительно короткий период времени характерное для опреде­ленных территорий двухволновое течение инфекции имеет свойство перемещаться на значительное расстояние между отдаленными регионами. В частности, в недавнем прошлом, всего несколько де­сятилетий назад, двухволновый энцефалит был широко распро­странен только в западном и уральском регионах, а теперь — так­же и в сибирском регионе, где преимущественно распространен соответствующий сибирский генотип ВКЭ. Для более углубленного предметного обсуждения гипотетической связи между генотипом вируса и особенностями вызываемой им инфекции требуется более тщательное рассмотрение имеющихся в литературе сведений о мо­лекулярно-генетической природе вирулентности, нейропато­генности ВКЭ и о наблюдаемых гетерогенных патогенетических свойствах клещевого пула вируса в отдельных эпидочагах энде­мичных регионов и динамике клинических показателей природно-очаговой ВКЭ-инфекции во времени.

Из приведенных выше данных также следует, что видовые раз­личия иксодовых клещей–носителей вируса в Сибири ( I. per­sulcatus) и в европейской части России ( I. ricinus) не отражаются прямо в клинической картине ВКЭ-инфекции в этих регионах.

5.3. Молекулярные основы нейровирулентности вируса

Сравнительный анализ нейровирулентности в эксперимен­таль­ной инфекции показывает различную активность штаммов ви­руса в пределах одного отдельного генотипа. Например, в экспе­ри­ментальной модели клещевого энцефалита на мышах среди ви­ру­сов западного субтипа штамм Hypr более вирулентен, чем про­тотипный штамм Найдорф [66], а среди вирусов дальневос­точного субтипа, кроме высоковирулентного штамма Софьин, по­ка­зано существование ряда менее вирулентных штаммов, отли­чающихся также нейровирулентностью между собой. Например, у мышей штаммы Oshima 5-10 и Хабаровск 98-10 более пато­ген­ны, чем штаммы Oshima I-1 и Хабаровск 98-5 [46].

Наличие штаммовых различий вируса в развитии манифест­ной инфекции иногда проявляется не только количественно, как отмечено в приведенных выше примерах, но и качественно. В работе [6] штамм ВКЭ, названный Пищелкин, изолированный из мозга человека, умершего от клещевого энцефалита, и другой, также дальневосточный, штамм ВКЭ 155, изолированный из кле­щей I. persulcatus, высоковирулентные на модели новорожденных белых мышей и вирулентные на экспериментальной модели золо­тистых хомячков, вызывают на этих двух моделях патологический процесс различного характера. Вирус штамма Пищелкин проявил себя по всем показателям как типичный нейровирулентный штамм, который, репродуцируясь в первую очередь в мозге, затем в крови и селезенке, приводит к нарастающим изменениям в ЦНС — менингоэнцефалиту с выраженными воспалительными явлениями и дегенеративными поражениями нейронов на фоне раз­вивающегося иммунодефицитного состояния. Другой виру­лент­ный штамм 155 вызывал два подъема титра вируса в мозге и в крови животных, что можно трактовать как двухволновое течение инфекции. Несмотря на внутримозговой способ заражения, этот штамм по сравнению с первым приводил к самым значительным изменениям в тимусе и селезенке, свидетельствующим о глубоких поражениях клеток иммунной системы. В то же время, в ЦНС хомячков этот штамм вируса вызывал также сосудистые нару­ше­ния с выраженным отеком мозга при относительной сохран­ности нейронов. Такое течение инфекции, вызванное штаммом 155 ВКЭ, рассматривается как вирусный нейроиммунопа­толо­ги­ческий процесс.

Как установлено экспериментально, изменение нейровиру­лент­ных свойств ВКЭ происходит в процессе пассирования вируса через мозг восприимчивых животных. В работе [7] на примере штамма 205 ВКЭ, используемого для производства инактиви­ро­ван­ной вакцины, показано, что в процессе пассирования вируса через мозг высокочувствительных животных не происходит изме­нений его инфекционной активности на культуре клеток и нейро­ви­рулентности при исследовании на мышах. В то же время, уста­нов­лено повышение нейровирулентности вариантов вируса, про­шед­ших 10 и 20 внутримозговых пассажей на мышах при иссле­довании вируса на модели низкочувствительных к этому штамму ви­руса сирийских хомячков. С помощью МКА выявлены анти­ген­ные различия в двух эпитопах белка Е и в двух эпитопах бел­­­ка NS3 вариантов вируса 205 до и после 20 пассажей на мы­­шах. Таким образом, изменение нейровирулентных свойств ВКЭ, по-видимому, связано с эволюцией тонкой структуры ви­рус­ных антигенов с последующими изменениями их функции и ак­тивности. В работе [8] с другим штаммом ВКЭ после прове­де­ния 7 пассажей через I. ricinus наблюдали персистентную инфек­цию у мышей, зараженных таким штаммом, вместо активной ре­пли­кативной инфекции для исходного штамма вируса до пас­си­­рования. Как отмечается авторами, снижение вирулентности ВКЭ в процессе пассирования произошло с изменением всего одного аминокислотного остатка в белке Е оболочки вируса. Однако, и до­­пол­нительные замещения аминокислотных остатков, кодируе­мых другими частями вирусного генома, авторами не исклю­чаются.

В обзорной статье McMinn [65] приведены сведения по кар­ти­рованию сайтов геномов флавивирусов, ответственных за нейро­ин­вазивные и нейровирулентные свойства вирусов. При этом нейро­инвазивность характеризует свойство вируса реплици­ровать­ся в периферических тканях и индуцировать вирусемию в ЦНС пу­тем проникновения через гематоэнцефалический барьер. Нейро­ви­рулентность обозначает свойство вируса инициировать цитопа­ти­ческую инфекцию в ЦНС и вызывать энцефалит. В обзоре при­во­дятся результаты работы Holzmann и др. [67], где амино­кис­лотные замены в поз. 384 Tyr®His и поз. 368 Gly®Ala на бо­­ковой поверхности домена III третичной структуры белка Е ВКЭ ассоциируются с потерей нейроинвазивности на мышиной модели инфекции клещевого энцефалита. Мутационная замена в поз. 368, по-видимому, приводит к изменению конформационной подвижности фрагмента полипротеина белковой молекулы при изменении рН.

А.Г. Плетнев и др. на сконструированной ими инфекционной кДНК-химере вируса Денге-4 и ВКЭ с встроенными генами preM и Е показали, что, в отличие от низковирулентного векторного ви­руса Денге-4, кДНК-химерный вирус обладает высоко­нейро­вирулентными свойствами, характерными для исходного ВКЭ — донора структурных генов [68]. Однако, химерный вирус не обла­дал нейроинвазивными свойствами, присущими ВКЭ — донору струк­турных белков. Изученные авторами мутации в гене белка Е, в соответствующем сайте гликозилирования поз. 154 Asp®Leu (домен I на модели димера молекул белка Е) и в сайте расщепления preM/M, значительно снижают нейровирулентность химерного вируса ВКЭ/Денге-4 на модели мышей и устраняют его реп­ли­кацию в культуре клеток. Обе мутации приводят к значительному снижению экспрессии вирусного гликопротеина. Эти результаты показали, что детерминанты нейроинвазивности, нейровиру­лент­ности и тем самым нейропатогенноси ВКЭ связаны с точечными мутациями, локализованными внутри генов структурных белков этих вирусов. Эти детерминанты вируса расположены на поверх­ности димера белка Е и так же, как и центры нейтрализации ви­­руса, сгруппированы на доменах I-III поверхностного белка.

Влияние отдельных аминокислотных остатков на поверхнос­ти белка Е на вирулентные свойства ВКЭ исследовано методом сайт-направленного мутагенеза [22]. Четыре аминокислотных ос­тат­ка (поз. 308–311), локализованные на боковой поверхности до­­мена III белка Е, являются частью предполагаемого центра свя­зывания с клеточными рецепторами для флавивирусов. Были сконструированы мутанты вируса, содержащие одиночные замены а.о., так же, как и комбинации таких мутаций, и проведен анализ вирулентности мутантов на мышах, их вирулентных свойств на культуре клеток и их генетической устойчивости. Наиболее зна­чи­тельная аттенуация вируса достигалась мутацией Thr-310. Ком­бинация этой мутации с делецией в 3’-нетранслируемом регионе генома вируса дает значительный выход аттенуировнного вирус­ного штамма. Биологический эффект мутации Thr-310 к Lys, од­нако, мог быть в значительной мере утерян мутацией в соседнем положении (Lys 311 ® Gly), которая появляется спонтанно при ин­фицировании мыши мутантным вирусом. Мутации в других позициях а.о. также показывают важность а.о. 308 (Asp) и его взаи­модействия с зарядами а.о. 311. В то же время, а.о. 309 мог быть замещен или утерян без заметных биологических пос­лед­ствий. Делеция а.о. 309 сопровождалась спонтанной мутацией в поз. 332 (Phe ® Tyr), которая на трехмерной структурной модели белка Е пространственно соседствует с а.о. 309. По-видимому, про­цессы аттенуации нейровирулентности ВКЭ, прежде всего, ассоциированы с нарушениями в ранних этапах связывания виру­са с нейроном и расплавления клеточной и вирусной мембран.

Как рассматривалось выше, анализ первичной нуклеотидной и аминокислотной последовательностей поверхностного вирусного белка Е выявил наличие как минимум трех генотипов ВКЭ. В пределах отдельного генотипа штаммы вируса отличаются между со­бой вирулентными, висцерально- и нейропатогенными свойст­ва­ми. Установленная генотипическая и штаммовая вариабель­ность ВКЭ, по видимому, связаны с высокой частотой спонтанных нуклеотидных замещений, характерных для РНК-геномных виру­сов. Это свойство генома предполагает высокую частоту точечных мутаций замещения нуклеотидов в нем и эволюционную гибкость вируса. У возбудителя природно-очаговой инфекции, в частности, в процессе циркуляции ВКЭ по цепи клещи–животные прокор­ми­­тели–клещи, естественный отбор приводит к постепенному за­креп­лению тех мутаций в геноме, которые лучше соответствуют из­­меняющимся условиям существования членистоногих носителей вируса и позвоночных прокормителей вирусофорных клещей в природной среде. В результате в наиболее важных, ключевых участках генома ВКЭ, в частности в гене белка Е, в течение дли­­тельного периода времени эволюции вируса формируются про­тя­­женные устойчивые фрагменты с характерными генотипичес­кими последовательностями нуклеотидов, генетически отражаю­щие соответствующие особенности природных условий длитель­ного существования ВКЭ в пределах региона в целом. В то же вре­­мя на фоне формирования стабильных генотипических после­до­вательностей нуклеотидов в составе гена имеет место более ди­­намичное закрепление других дополнительных мутаций, веду­щих к формированию многочисленных штаммов вируса, отражаю­щих мозаику местных эпидочаговых особенностей природных условий. Постепенное изменение местных условий существования вируса в изолированном эпидочаге со временем индуцирует за­креп­ление новых мутаций в нуклеотидной последовательности гена и приводит к отбору и накоплению новых штаммов вируса, луч­ше приспособленных к изменившимся природным условиям. При этом, коль скоро изменение нейроинвазивных, нейрови­ру­лент­ных свойств или нейропатогенности ВКЭ связано со спон­тан­ным появлением единичных или отдельных кластерных нук­лео­тид­ных мутаций замещения в гене Е, то следует ожидать, что штаммы вируса одного генотипа между собой будут отличаться ге­терогенностью патогенетических свойств.

5.4. Молекулярно-генетическая гетерогенность изолятов вируса и их патогенность

Установление первичной нуклеотидной последовательности полного генома ВКЭ сделало возможным химический синтез оли­гонуклеотидных ДНК-зондов, комплементарных к любым ра­нее выбранным фрагментам известной геномной последова­тель­ности вирусной РНК. Гибридизационный анализ нуклеиновых кислот с применением вирусоспецифических ДНК-зондов к наи­бо­лее консервативным областям вирусного генома, в первую очередь, использовался в лабораторном анализе для выявления РНК ВКЭ в исследуемых клещах, инфицированной культуре клеток, образ­цах тканей различных органов и крови от инфи­ци­рованных виру­сом людей и животных. Следующий значительный шаг в примене­нии гибридизационного анализа РНК ВКЭ в иссле­дованиях кле­ще­вого энцефалита был сделан синтезом целого на­бора ДНК-зон­дов для характерных фрагментов вирусного генома по всей его длине. В первую очередь, были проведены лабораторные и полевые исследования с использованием набора синтетических ДНК-зондов, комплементарных к коротким фрагментам вирусной РНК с определенным положением на генетической карте в концевой 5’-области, С-, рreM-, М-, Е- и NS1- генах ВКЭ штамма Софьин [4]. Из опубликованных авторами данных по гибри­ди­зации олигонуклеотидных зондов, комплементарных к указанным участкам геномной РНК, следует, что в ходе многократных, до 15 последовательных, пассажей вируса в мозге новорожденных белых мышей происходят постепенные изменения в нуклеотидной последовательности вирусного генома. Высокая частота измене­ний, по гибридизационным данным, характерна для участков ге­­нома, кодирующих белки preM-, М-, С- и NS1. Наиболее кон­сер­вативны, как это было ранее известно и из других работ, последовательности нуклеотидов, кодирующие 5’-концевую об­ласть генома, белки Е и NS3. С другой стороны, как уста­новлено в экспериментах с иксодовыми клещами, иногда доста­точно од­но­го пассажа вируса через организм членистоногих, чтобы проис­ходили значительные изменения в режиме гибридизации зондов не только с вариабельными, но и с консервативными об­ластями ви­русного генома. Исходя из этих и ряда аналогичных данных, ав­то­рами пред­полагается, что иксодовые клещи как основной резервуар вируса в природе выступают в качестве организма под­дер­жания более широкой штаммовой гетерогенности вируса. Позво­ночные прокормители инфицированных вирусом клещей, на­против, служат альтернативным механизмом сужения диапа­зо­на гетерогенности вирусного генома. С последующим частым и дли­тельным пассированием вируса через позвоночных происходит постепенная адаптация его к определенному более узкому кругу по­звоночных прокормителей в природе, что, по-видимому, посте­пенно приводит к снижению патогенности ВКЭ для человека.

Из полученных экспериментальных данных следует, что в про­цессе последовательных репликаций ВКЭ в восприимчивом орга­низме его геном весьма изменчив, и, следовательно, любой при­­родный изолят этого вируса представляет собой один из штам­мов гетерогенного по своим молекулярно-генетическим характе­рис­­тикам клещевого вирусного пула из близкородственных штаммов.

В этой связи возникает вопрос о возможности различной па­­то­­­генности вирусных изолятов, как в пределах одной терри­то­ри­и или природного очага, так и устойчивого при­родно-очагового пула вируса в целом в отдаленных регио­нах, в том числе, с ге­но­типическими различиями вируса и видовы­ми различиями при­род­ного резервуара вируса. В частности, на Дальнем Востоке представляло интерес изучить молекулярные основы террито­ри­аль­ного пула ВКЭ, который, по данным многолетних наблюдений, способен вызывать тяжелые клинические формы клещевого эн­це­фалита на территории Южно-Сихоте-Алиньского очага значи­тель­но чаще, чем в других регионах [5]. Образцы местных изоля­тов ВКЭ по источникам выделения были распределены на 4 груп­пы. Первая группа включала в себя 8 штаммов ВКЭ, изо­ли­ро­ван­ных из основного резервуара и переносчика вируса изу­чае­мо­го региона — клещей вида I. persulcatus. Вторую группу, сос­тоя­щую из 10 штаммов, выделенных из мозга людей, умерших от кле­­щевого энцефалита, можно рассматривать как искусственно ото­бранную часть пула высоковирулентных для человека изоля­тов, обладающих способностью вызывать тяжелую нейро­инфек­цию с летальным исходом. Третья группа объединяла 7 штаммов, вы­деленных из крови больных лихорадочной формой клещевого эн­цефалита, у которых инфекционный процесс огра­ни­чился вис­це­­­ральной фазой. Четвертая группа штаммов, состоя­щая из 13 не­­­патогенных изолятов, выделенных из крови клини­чес­ки здоро­вых людей, представляет группу малоизученных штам­мов вируса, так как общепринятыми способами изоляции, они, как правило, не выделяются. Для гибридизации с иссле­дуе­мыми образцами РНК ВКЭ была использована более предста­ви­тельная, отно­си­тель­но набора зондов предыдущих авторов, кол­лек­ция олиго­нук­леотидных зондов, дополнительно включающая также специ­фи­ческие зонды на NS2 и NS4 гены ВКЭ штамма Софьин.

По результатам анализов абсолютное большинство штаммов 4-й группы (92,3%) реагировало всего с 2–4 зондами, все штаммы вируса 3-й группы (100%) — с 5–7 зондами. «Мозговые» штаммы 2-й группы в 60% случаев реагировали с 5–7 зондами и в 40% слу­­чаев с 8–10 зондами, что в большей степени соответствует ха­­­рактеристике штаммов типа Софьин. Первая группа «клеще­вых» штаммов была самой разнообразной, здесь выявлено более 40% изолятов, подобных штамму Софьин, 14,3% штаммов с гене­ти­ческой характеристикой 2-ой и 3-ей групп и 42,8% штам­мов, подобных 4-й группе.

«Клещевые» штаммы с большим разнообразием генофонда мож­но рассматривать как более гетерогенный матричный пул штаммов ВКЭ, типичный для изучаемого региона. Здесь пред­став­лены изоляты с разной патогенетической характеристикой. Среди них, как полагают авторы, около 60% образцов вируса со­­ставляют штаммы, способные вызывать у человека заболевание как в легкой лихорадочной форме, так и тяжелую нейроинфекцию с летальным исходом. С другой стороны, около 40% образцов ви­­­руса — это штаммы с типичной генетической характеристикой 4-ой группы изолятов, не вызывающие клинических симптомов заболевания. Штаммы ВКЭ, изолированные из мозга умерших и крови больных людей, представляют относительно однородную группу по сравнению со штаммами, изолированными из клещей. Таким образом показано, что локальный природный пул ВКЭ благодаря молекулярно-генетической неоднородности вирусных РНК способен вызывать как манифестные тяжелые и легкие фор­мы клещевого энцефалита, так и бессимптомные формы ВКЭ-ин­­фекции.

При этом по уровню специфической активности зонды были подразделены на 3 группы, что позволило дать качественную ха­рак­теристику штаммов ВКЭ в виде гетерогенных молекулярно-генетических вариантов [54]. Группа штаммов, изолированных из клещей, характеризуется более выраженной гетерогенностью, включая все 3 молекулярно-генетических варианта. Выявлена неоднородность распределения молекулярно-генетических вари­ан­тов вируса среди штаммов, изолированных из организма чело­ве­ка с различными формами инфекции. У инаппарантных обследуе­мых доминировали штаммы III генетического варианта (84,6%), а затем II — 15,4%, напротив, при очаговых формах ВКЭ-инфек­ции доминировали штаммы вируса II генетического варианта до 75% и I-го до 25%. При лихорадочной форме клещевого энцефа­лита примерно одинаково наблюдались все 3 гетерогенных моле­кулярно-генетических варианта ВКЭ.

Таким образом, широко вариабельные проявления клещевого энцефалита в эпидочаге ассоциированы с гетерогенными свойст­ва­ми геномов штаммов вируса — возбудителя инфекции в клеще­вом пуле. По-видимому, геном дальневосточного клещевого пула ВКЭ обладает наиболее гетерогенными свойствами и в целом пред­став­ляет сочетание более вирулентных, потенциально очагово-энце­фалитогенных штаммов вируса по сравнению с клещевыми пулами вируса в сибирском и западном регионах распространения инфекции.

По результатам молекулярно-биологического изучения ВКЭ, экспериментальных исследований молекулярных основ нейропато­ген­ности в механизме ВКЭ-инфекции и с учетом гетерогенности па­тогенетических свойств очагового клещевого пула ВКЭ следо­вало ожидать значительных вариаций в клинических проявлениях клещевого энцефалита не только по регионам распределения отдельных генотипов вируса, но также и по отдельным эпидочагам в пределах территории распространения одного и того-же генотипа вируса. Региональные эпидочаги не представляют собой по ланд­шафтным, климатическим условиям однообразный массив, а естественную весьма разнообразную по природным условиям совокупность горных, таежно-лесных, озерно-речных, смешанных таежно-луговых, лесостепных и прочих районов. На самом деле, на­равне с усредненными клинико-эпидемиологическими данными по регионам, как это представлено в табл. 2 и обсуждалось выше, в отдельных природных очагах клещевого энцефалита наблюда­ют­ся существенные различия в клинических проявлениях инфек­ции. Отмечено [52], что в Читинской области Восточной Сибири установлена высокая частота очаговых форм — до 47,6%, и та­­кая особенность приближает клещевой энцефалит к дальневос­точному типу, а отсутствие полирадикулоневротических форм отличает инфекцию от клещевого энцефалита в Западной Сибири, где эта форма наблюдается часто. В Забайкалье отмечается очень редкое (0,8%) осложнение, кожевниковская эпилепсия, по срав­не­нию с данными по соседней Читинской области ( 5,7%). Хрони­чес­кие формы клещевого энцефалита по отношению ко всем пере­болевшим в Новосибирской области составляют 0,9%, Томской — 1,0%, а в Иркутской области — 24,7%. Такая мозаичность в ха­рактере клинических проявлений клещевого энцефалита по отдельным очагам инфекции общепризнана. При этом выявленные различия в клиническом течении клещевого энцефалита в таежной и лесостепной зонах, в частности, в Тогучинском районе Новоси­бирс­кой области, как предполагает А.П. Иерусалимский, объясня­ются различными свойствами таежных и лесостепных штаммов ВКЭ [1].

Эпидочаговые особенности клинических проявлений инфек­ции, по-видимому, связаны с динамически устанавливающимися соотношениями вирусных штаммов с различными антигенными свойствами и различной степенью патогенности внутри клещевого пула вируса на различных эндемичных по клещевому энцефалиту территориях и районах. А статистически достоверные, интеграль­ные особенности клинических проявлений инфекции в обширных гео­графически удаленных регионах [44] могут представлять собой некоторую постоянную составляющую, связанную с преимущест­венным распространением отдельных генотипов или субтипов вируса в регионе на повсеместном гетерогенном молекулярно-ге­не­тическом фоне вирусов клещевого пула.

Как отмечается автором книги [1], клиника клещевого энце­фалита в Прокопьевском районе Кемеровской области прослежена на протяжении 20 лет (1942–61гг.) и трижды описывалась с де­ся­ти­летними интервалами. Сопоставление клиники и исходов забо­ле­вания в 1942 г., в 1952 г. и в 1960–61 гг. отчетливо по­ка­зывает неук­лонную эволюцию его с четко выраженной тен­денцией ко все более легкому, благоприятному течению. Из очень тяжелого, грозного нейроинфекционного заболевания, нередко приводящего к смерти и часто оставляющего после себя калечащие последствия, клещевой энцефалит в Прокопъевском районе всего за два деся­ти­летия превратился в болезнь, далеко не всегда про­те­кающую по типу нейроинфекции. Из приведенных в книге дру­гих источ­ников также известно об изменениях клиники клещевого энце­фа­лита в одном и том же очаге с течением времени в Екатерин­бург­ской, Томской, Новосибирской, Читинской областях, Красно­ярском, Хабаровском и Приморском краях. Есть аналогичные со­об­щения из европейской части России и отдельные сведения из восточной и центральной Европы.

При этом направленность эволюции клинической картины ВКЭ-инфекции во времени, за исключением дальневосточных оча­гов клещевого энцефалита, повсеместно одинакова. Наблюдается все более легкое клиническое течение аналогичных синдромов, пе­рераспределение соотношения клинических синдромов острого пе­риода в пользу преобладания лихорадочных и менингеальных форм со снижением процента клинических форм с поражением спин­ного мозга и стволового отдела головного мозга. Отмечается уча­щение двухволнового течения ВКЭ-инфекции, значительное улуч­­шение исходов болезни. По перемещению обширной зоны бо­лее высокой распространенности двухволновой формы менин­го­энцефалита просматривается также глобальная широтная на­прав­ленность с запада на восток эволюции инфекции, связанной с особым сочетанием гетерогенных свойств клещевого пула вируса. Установленная повсеместно тенден­ция смягчения клинической кар­тины болезни в последнее время, по-видимому, связана с воз­рас­танием частоты и длительности пас­сирования вируса через по­звоночных прокормителей клеща по сравнению с частотой и дли­тельностью пассирования вируса че­рез членистоногих носи­те­лей вируса. При этом исследователи обращают внимание на по­вышение роли многочисленных домаш­них животных в качестве про­кормителей вирусофорных клещей в западном и сибирском ре­гионах в последнее время. В этих усло­виях воспроизводства и под­держания клещевого пула вируса в природе, как это отмеча­лось выше, может произойти посте­пен­ное сужение диапазона ге­терогенности вирусного генома, его анти­генной и штаммовой ге­терогенности с аттенуацией патогенных свойств ВКЭ.

В заключение А.П. Иерусалимский пишет: «три вида разоб­ран­ных нами различий клиники клещевого энцефалита: различия клиники в разных географических районах его ареала, различия клиники в близколежащих ландшафтных разностях и изменение клиники заболевания в одном очаге с течением времени отражает собой единый процесс — эволюцию болезни». Как представляется из дополнительного рассмотрения результатов молекулярно-био­ло­гических, экспериментально-лабораторных и других работ, при­ве­денных в настоящем обзоре, наблюдаемая эволюция клещевого энцефалита отражает эволюцию ВКЭ, гетерогенных молекулярно-генетических, антигенных, иммуногенных и соответствующих па­то­­генетических свойств очагового клещевого пула возбудителя при­родно-очаговой инфекции с течением времени. При этом, эво­лю­ция ВКЭ, которая отражается в эволюции инфекции, по-види­мо­му, происходит как статистически случайный процесс измене­ния гетерогенных генетических свойств всех вирионов, состав­ляющих единый клещевой пул вируса, а не как изменение генома отдельно взятого изолята вируса (прототипа).

Основная причина наблюдаемой эволюции клещевого энцефа­лита, как предполагается рядом исследователей, что справедливо и для эволюции гетерогенных патогенетических свойств клещевого пула ВКЭ, заключается в природопреобразующей деятельности человека в ареале распространения иксодовых клещей — основных носителей вируса. В результате экспансивной жизнедеятельности человека естественные таежные эпидочаги клещевого энцефалита постепенно преобразуются в антропургические очаги с изменением растительного и животного мира в них. Это отражается в эволю­ции ВКЭ с его растущим приспособлением к домашним позвоноч­ным прокормителям инфицированных вирусом клещей. Частое и длительное пассирование вируса через клетки позвоночных приводит к сужению молекулярно-генетической гетерогенности его генома и аттенуации патогенности вируса. Более заметная эволюция клещевого энцефалита в сибирском регионе в последнее время, по-видимому, связана с ускоренной эволюцией ВКЭ в этом регионе из-за интенсивного освоения южных районов Сибири человеком во второй половине прошлого века. Произошла массо­вая вырубка леса, распахивание больших площадей земли, что повсеместно сопровождается вытеснением редких крупных лесных прокормителей клещей многочисленным домашним скотом. Со­хра­нение тяжелой клиники клещевого энцефалита и более высо­кая смертность пациентов при этой инфекции на Дальнем Востоке, по-видимому, могут быть объяснены более замедленной эволюцией нейропатогенного клещевого пула ВКЭ в эпидочагах инфекции из-за лучшей сохранности таежных природных условий в этом регионе до настоящего времени.

Таким образом, нозогеографические особенности клещевого энцефалита определяются гетерогенными молекулярно-генетичес­кими и соответствующими патогенетическими антигенными свойствами штаммов эпидочагового клещевого пула ВКЭ на опре­деленной территории, а эволюция гетерогенных патогенетических свойств ВКЭ и, соответственно, эволюция природно-очаговой инфекции клещевого энцефалита, по-видимому, отражают изме­нения природно-антропогенных условий существования вируса в ареале распространения носителей инфекции во времени. По срав­нению с относительно быстро меняющимися важными факторами воздействия природных условий на гетерогенный геном эпидоча­гового клещевого пула вируса генотипические различия вируса или видовые различия его носителей — иксодовых клещей на кли­ни­ческих особенностях клещевого энцефалита отражаются не существенно.

На основании наблюдаемой тенденции в эволюции природно-очаговой инфекции клещевого энцефалита в Евразии можно по­пы­таться прогнозировать дальнейшую эволюцию смягчения кли­ни­ческой картины клещевого энцефалита в Сибири в последующие десятилетия с превращением ее в лихорадочную и менинго­энце­фалитическую инфекцию по аналогии с клещевым энцефалитом в Европе. Фактором, замедляющим эту тенденцию, может стать постепенное распространение носителя вируса в Сибири, клеща I. persulcatus, в более северные труднодоступные для освоения че­ловеком широты, связанное, например, с глобальным потепле­нием и смягчением климата. Это может расширить ареал распро­ст­ранения клещевого энцефалита в северном направлении с во­влечением в него мало освоенных таежных районов Сибири и, как следствие, поддержать более высокую молекулярно-генети­чес­кую гетерогенность штаммов клещевого пула вируса и спо­соб­ствовать сохранению относительно тяжелых форм клеще­вого энцефалита в регионе.

6. Изучение патогенеза клещевого энцефалита

6.1. Репликативная, персистентная и интегративная инфекции

Рассмотренные выше результаты молекулярно-биологи­чес­ких, экспериментальных исследований ВКЭ и изучения клиники клещевого энцефалита дают представления об этиологии, о гете­ро­генных свойствах клещевого пула вируса и связанных с этим особенностях вирусной природно-очаговой инфекции клещевого эн­цефалита, ее эволюции. Медицинские аспекты проблемы кле­ще­вого энцефалита теснее связаны с патогенезом инфекции у па­циента — совокупностью последовательных процессов, опреде­ляю­щих возникновение, развитие и исход нейроинфекции.

ВКЭ проникает в организм человека через кожу при укусе клеща или через пищеварительный и желудочно-кишечный трак­ты в случае алиментарного заражения при приеме зараженного ви­­­ру­­сом молока. Как предполагается, в первом случае местом пер­­­вичного размножения вируса являются кожа и подкожная клет­чатка. При алиментарном заражении происходит быстрая фик­сация вируса не только в эпителиальных клетках верхнего от­­дела пищеварительного тракта, но и в тканях желудочно-ки­шеч­ного тракта. Затем, как в первом, так и во втором случаях, проникая через капилляры в систему крово- и лимфообращения, вирус начинает размножаться в эпителии кровеносных и лимфатических сосудов, лейкоцитах крови и вместе с ними попадает и размножается в органах иммунной системы, рети­ку­ло­эндотелиальной системы, в клетках печени (клетки Купфера), почек и селезенки. Как было показано в лабо­ра­торных исследо­ва­ниях in vitro, заражение ВКЭ лейкоцитной мас­сы человека ве­­дет к активной адсорбции вируса на клетках с последующим ла­тентным периодом инфекции на протяжении первых суток и к ин­тен­сивному накоплению вируса как в лейкоцитах, так и в на­­до­садочной жидкости со вторых по пятые сутки. Интен­сив­но раз­м­но­жаясь во внутренних органах, вирус может посте­пен­но про­­ни­кать в периферическую невральную и центральную нервную систе­мы. Вопрос о том, преимущественно через гема­то­генный, лимфо­ген­ный или невральный (через проводящие нервный им­пульс нейроны периферической нервной системы) пути вирус по­па­дает в мозговые структуры ЦНС, до сих пор остается предметом дис­кус­сии среди исследователей. Не исключено, что в зависимости от гетерогенности антигенных свойств клещевого пула вируса, мо­жет реализоваться тот или иной путь проникновения отдель­ных штаммов вируса в ликвор и определенные отделы ЦНС.

Как висцеральная, так и невральная фазы острого клещевого эн­цефалита с лихорадочными, менингеальными и очаговыми симп­то­мами, и хронический клещевой энцефалит патогенетически свя­заны с репликативным, персистентным и, вероятно, еще инте­гра­тив­ным механизмами процессов внутриклеточного воспроиз­вод­ства вируса или сохранения генома ВКЭ в клетках инфициро­ванного макроорганизма. Если в результате активной репликатив­ной ин­фекции наблюдается интенсивное накопление инфекцион­ного вируса в тканевых клетках и крови, то в процессе персис­тент­ной инфекции зрелый, инфекционный вирус в клетках и кро­ви не накапливается, а постепенно на очень низком уровне вы­деляется из организма в течение продолжительного периода вре­мени. Как выше отмечалось, в процессе репликативной ин­фек­ции клещевого энцефалита наряду с инфекционными вирусны­ми частицами из инфицированной вирусом клетки выходят непол­но­ценные ин­тер­ферирующие вирусные частицы и неполные вирио­ны, не содер­жащие нуклеоида, в виде полых цилиндрических час­тиц вирусной природы, по-видимому, формирующиеся за счет избытка экс­прес­сии белков нуклео- и суперкапсидной оболочки вируса. В экспе­риментах по инфицированию обезьян ВКЭ штамма Айна или Ва­сильченко в течение длительного времени только в 3-х случаях из тканей был выделен вирулентный или умеренно вирулентный вирус, который вызывал бляшкообразование в куль­туре куриных эмбрионов и цитопатическое действие в пере­виваемой культуре почек эмбриона свиньи (СПЭВ). В 37 случаях в тканях ин­фици­ро­ванных обезьян обнаружен только вирусный антиген при отсут­ст­вии инфекционного вируса. Флавивирус из анти­генного комп­лек­са клещевого энцефалита — низкопато­ген­ный вирус Лан­гат, штамм TР-21 — сразу формирует в клетках зара­жен­ных жи­вот­ных, в том числе в нейронах, персистентную ин­фекцию, при ко­торой на фоне активного синтеза вирусного бел­ка резко вы­ра­жен дефицит продукции инфекцион­ного вируса. Таким об­ра­зом, имеющаяся информация по пато­ге­незу клещевого энце­фа­лита до­пускает обоснованность предположе­ния о том, что в ин­­фици­ро­ванной клетке параллельно с процессами реплика­тив­ной ин­фекции также могут протекать процессы персис­тентной вирусной инфекции. Если при остром клещевом энцефа­лите про­цессы реп­ли­кативной и персистентной инфекции часто могут быть совме­щены, то прогредиентная и, в особенности, хро­ни­ческая ин­­фекция, по-видимому, поддерживаются преимущественно за счет процессов ви­русной персистенции.

Механизм персистентной вирусной инфекции, в отличие от репликативной, не имеет цитопатического действия, персис­тент­ная инфекция со временем непременно устанавливает режим дли­тельной сохранности вирусного генома в инфицированной клетке. Длительное персистентное сосуществование вируса и клетки воз­можно только при устранении элиминирующего вирус из орга­низ­ма действия клеточно-гуморальной иммунной системы макро­организма [42].

Для выявления причин вирусной персистенции в иммунном организме были проведены эксперименты по инфицированию обе­зь­ян макака-резус и сирийских хомячков мутантными штам­ма­ми ВКЭ, происходящими от штаммов Айна/1448 и 41/65, выде­ленных от больных хроническим клещевым энцефалитом, а также от штамма Васильченко, изолированного от больного стертой фор­мой клещевого энцефалита. Широкое распределение персис­тирующего ВКЭ в организме возможно, если вирус сохраняется в тех же тканях, где был локализован в ранние сроки инфекции и продолжает персистировать в длительно и коротко живущих клет­ках, преодолевая действие элиминирующих иммунных механиз­мов. Устойчивое персистирование инфекции также возможно, если вирус повторно распространяется в иммунном организме. Изученные варианты ВКЭ сохраняли способность вызывать ви­ру­семию, т.е. распространяться экстрацеллюлярным путем, кото­рый контролируется антителами. Не обнаружены различия в ан­ти­генной специфичности роди­тель­ских и мутантных, персисти­ро­­вавших штаммов вируса. Полагают, что персистенция ВКЭ в иммунном организме не связана с фено­меном антигенного дрейфа в такой степени, как, например, пер­систенция вируса Висна или вируса гриппа. В то же время, пер­систенция ВКЭ приводит к из­­менению ряда его характеристик: снижению авидности, повы­ше­нию способности сенсибилизировать Т-лимфоциты, более выра­жен­ной зависимости репродукции от интерферона. Для поддержа­ния персистентной инфекции ключевыми представляются два мо­мента: сохранение вируса в клетках и особый способ распрост­ра­нения в иммунном организме.

В местах локализации in situ персистирующий ВКЭ более чем в 90% случаев формирует абортивный или латентный тип ин­­­фекции без экспрессии антигенов, патогенных и цитодест­рук­тивных свойств. В инфицированных клетках сохраняется вирус­ная генетическая информация при нарушенном процессе сборки вирионов и репродукции инфекционного потомства. В персис­тент­ной инфекции иммунные механизмы, по-видимому, стано­вятся факторами, регулирующими экспрессию вирусного генома. Воздействие иммунодепрессивных и антиинтерферонных факторов (ЦФА, стрептомицин, антиинтерфероновая сыворотка) может при­во­дить к снятию блока репродукции вируса. В том случае, ког­да пер­систирующий вирус не имеет существенных дефектов в геноме, по крайней мере, в генах, кодирующих антигенные и патогенные свойства, эти свойства реализуются.

Сохранение и распространение персистирующего ВКЭ также допускается делением зараженных клеток или через межклеточные контакты. Культуру Нер-2/Софьин, хронически инфициро­ванную ВКЭ, в течение одного года пассировали в присутствии специ­фи­ческих противовирусных антител; по результатам лаборатор­ных анализов при отсутствии инфекционного вируса в культу­ральной среде вирус регулярно выявлялся в дочерних клетках [14].

Возможность реализации другого механизма вирус-клеточного взаимодействия — интегративной инфекции клещевого энцефа­ли­та в клетках мозга больных с прогредиентным и хроническим те­­­че­­нием инфекции — впервые была показана в работах В.М. Жданова и И.Ф.Баринского с соавторами еще в 70-х годах прошлого столетия [35, 36]. По изложению Погодиной с соавто­ра­ми основных ре­зуль­татов этих работ [14], инфекционность ядер­ной ДНК и отсут­ствие инфекционности цитоплазматической ДНК инфицированной ВКЭ лимфоидной клеточной линии Л-101, сви­детельствует в пользу встройки провирусной ДНК в клеточный геном. Полагают, что образование ДНК-провируса в системе хрони­чески инфици­рованной ВКЭ перевиваемой клеточной линии НЕр-2/Софьин осуществляется посредством обратной транскрип­та­зы ретровируса или клетки. Косвенным указанием на интегра­тив­ный механизм взаимодействия служит влияние 5-бром-2-дезок­сиуридина (БУДР) на синтез вирусного антигена в культуре клеток НЕр-2/Софьин. Анализ кинетики процесса гибридизации нуклеи­но­вых кислот позволил установить, что на гаплоидный набор клет­ки приходится 5,22–5,64 копии инкорпорированного вирус­ного генома. Вирус, клонированный из пула ДНК хронически инфи­цированных кле­ток, был идентифицирован как дефектный ВКЭ. Он был апато­ген­ным для мышей, слабоиммуногенным, имел дефект в суперкап­сидной оболочке.

Следовательно, можно предполагать, что латентно проте­каю­­­щему в течение многих лет хроническому клещевому энце­фалиту может соответствовать механизм инфекции с интеграцией вирусного и клеточного геномов. Латентная инфекция — бессимп­том­ная персистенция вируса, при которой не происходит вирусо­ло­гически доказуемой репродукции возбудителя. Обратная транс­формация персистирующей и (или) латентной интегративной инфек­ции в репликативную ВКЭ-инфекцию с вирусемией и возоб­нов­лением клинической манифестации, обострением болезни может быть вызвана воздействием как внешних, так и внутренних факторов активации инфекционного процесса. Внешними актива­то­рами инфекции клещевого энцефалита, как показано в экспери­менте, являются некоторые иммунодепрессанты и антибиотики.

Механизмы процессов персистентной, латентной ВКЭ-инфек­ции пока не изучены.

6.2. Размножение вируса в организме
и особенности развития инфекции

В исследованиях вирусемии ВКЭ в периферической крови человека было установлено, что из всего контингента укушенных клещом здоровых и больных клещевым энцефалитом жителей Приморского края инфекционный вирус изолируется преиму­щест­вен­но из лейкоцитов крови здоровых лиц. Из общего числа изоля­тов ВКЭ 84% штаммов были выделены из крови здоровых людей, уку­шенных клещами. И антигены ВКЭ определяются иммунофер­ментным методом значительно чаще в образцах крови от жителей, укушенных клещом, но оставшихся здоровыми, чем в крови от укушенных клещом больных [31, 32]. Таким образом, в этих ра­­­бо­тах показано, что после укуса клещом инаппарантная и стер­­тые лихорадочные формы инфицирования ВКЭ распространены намного шире, чем случаи клинически выраженного проявления инфекции в лихорадочной, менингеальной и очаговой формах. Эти работы, как пишут М.П. Исаева с соавт., дают более полное пред­ставление о гетерогенности природного вирусного пула, только небольшая часть которой способна вызывать острый кле­ще­вой энцефалит с выраженной клинической манифестацией.

При этом специфические антитела к ВКЭ в сыворотке оп­ре­де­­ляются в короткие сроки после укуса клеща у части всех инфи­ци­рованных, независимо от отсутствия или выра­жен­ности симпто­мов инфекции при последующих наблюдениях. У половины от чис­ла укушенных клещами, инфицированных виру­сом людей без симптомов болезни, антигенемия ВКЭ не сопровож­дается се­ро­кон­версией с выявлением противовирусных антител. Со време­нем титр противовирусных антител в сыворотках от лиц, у кого они выявляются, возрастает, однако, титры антител у инаппа­рант­­ных инфицированных ниже, чем у больных с ме­нин­геальной и очаговой формами инфекции. В конце наблюдений более частая сероконверсия и наиболее высокие титры антител обнаруживаются у тяжелых больных в очаговой форме.

Таким образом, инфекционные, иммуногенные и патогенные свойства штаммов вируса из территориального гетерогенного пула ВКЭ у инфицированных вирусом лиц проявляются вариабельно, и изменения этих свойств у инфицированных кор­ре­лируют между собой. Очевидно, значительная часть штаммов клещевого пула вирусной популяции инфекционна для человека. Однако не все, а только часть инфекционных штаммов обладает высокой иммуно­ген­ностью в человеческом организме и вызывает быстрое образо­вание вирусоспецифических антител, и, в свою очередь, только не­зна­чительная часть высокоиммуногенных по экспрессии специ­фи­ческих антител штаммов вируса также обладают высокой нейро­патогенностью. По мнению Г.Н. Леоновой и Г.С. Майстровс­кой с соавт. эти наблюдения согласуются с молекулярно-генети­ческими гетерогенными и связанными с ними патогенетически вариабельными свойствами вирусных штаммов в территориальном пуле ВКЭ, проде­мон­стрированными этими авторами в рассмот­рен­ной выше работе по гибридизации набора синтетических виру­со­специфических полинуклеотидных зондов с нуклеиновыми кислотами из образцов крови жителей Дальнего Востока [5].

При этом, по приведенным результатам наблюдений за 5 лет [31], наиболее часто — в 54,7% случаев — вирусные изоляты из образцов крови исследуемых могли быть выделены в первые 1–4 дня после укуса клещами. На 5–10-й день после укуса вероят­ность изоляции вируса из крови снижается значительно — до 9,6% случаев, а на 11–20-й день снова возрастает — до 25,0%. По истечении 20 дней и далее вирус выделяется снова с низкой частотой — в 6,3% случаев. Такая особенность изоляции вируса из крови инфицированных лиц во времени, по мнению авторов, отражает волнообразный характер вирусемии у обследованных. Следовательно, наблюдаемые в клинике случаи двухволновой ли­хорадки острого клещевого энцефалита также могут быть ассоциированы с более выраженной двухволновой вирусемией в периферической крови инфицированных. В острой вирусной ин­фекции проявление лихорадки — повышение температуры, боли и слабость — это результат процессов аутокринно-парак­рин­ной ак­тивации иммунокомпетентных клеток — натуральных килле­ров, макрофагов, нейтрофилов, Т- и В-лимфоцитов — ци­то­кино­выми медиаторами иммунитета (интерферонами, интерлей­кинами) с участием центральной нервной системы и является начальной ста­дией системной реакции организма на проникно­вение возбу­ди­теля инфекции — чужеродных вирусных антигенов [33, 34]. Оче­видно, первая волна лихорадки клещевого энце­фалита связана с развитием первой волны висцеральной вирусемии с репликацией ВКЭ в лейкоцитах, подкожных, эпителиальных клетках и, нако­нец, взаимодействием вируса в крови с иммунной системой макро­организма. Одновременно, как это следует из появления первых симптомов поражения нервной системы, можно предполагать, что вирус начинает реплицироваться также в клетках перифери­чес­кой нервной системы, распространяясь в организме гемато­генным, лимфогенным и/или нейрогенным путем. Проникновение и репликация вируса в спинно-мозговых нервах, клетках спинно­го мозга и далее в клеточных структурах шейной, затылочной зон головного мозга проявляются в виде развивающихся менин­ге­альных и иногда очаговых симптомов клещевого энцефалита. В том случае, если репликация вируса в нервной системе, в структурах мозга в пределах целостной струк­ту­ры гематоэнце­фа­лического барьера занимает достаточно длитель­ное время, ци­то­лиз инфицированных клеток и исполнительные механизмы кле­точно-гуморального иммунитета инфекции могут в значительной мере ингибировать висцеральную инфекцию и подавить вирусемию в периферической крови. Новая волна подъема вирусемии в крови и соответствующая повторная лихорадка у пациента тогда могут быть связаны с нарушениями структуры гема­то­энцефалического барьера в результате развития вирусной инфекции в тканях мозга. По-видимому, повреждение нативной структуры барьера и рост его проницаемости для вируса ассо­ци­ируются с значительными нарушениями тканевых структур мозга в результате интенсивной репликации вируса в них. В этом случае вирус, размножившийся в мозге в значительных концентрациях, по-видимому, снова попадает в кровь, интенсивно реплицируется в интактных клетках крови, вызывает новую волну вирусемии в крови и может снова усилить активацию иммуноцитов, индукцию плейотропных цито­кинов и ини­ци­ировать еще одну волну лихорадки с выра­женным менингеальным синдромом.

Такая волнообразная модель вирусемии и лихорадки острого кле­щевого энцефалита согласуется с неоднородностью и измен­чи­­востью нейропатогенных свойств штаммов ВКЭ из природного клещевого пула. Репликация части штаммов вируса ограничивает­ся толь­ко висцеральной инфекцией. Другая часть штаммов вируса также в той или иной мере способна реплицироваться, в основном, в клетках периферийной нервной системы. Только небольшая часть природной популяции вируса способна инфицировать опреде­лен­ные от­де­лы головного мозга. Висцеральная лихорадочная ин­фекция кле­ще­вого энцефалита, ограниченная репликацией вируса вне гемато­эн­цефалического барьера, протекает с одной лихо­рад­кой. Нейро­ви­рулентные высокопатогенные штаммы ВКЭ также вы­зы­вают развитие инфекции с одной продолжительной лихо­рад­кой в более тяжелой форме. В этом случае развитие инфекции в моз­ге и раз­рушение гематоэнцефалического барьера происходят достаточно быстро. Поэтому ко времени распространения вируса из мозга реп­ликация вируса в лейкоцитах, по-видимому, еще не успевает ин­гибироваться в значительной мере, и вирусемия во всем организме и в крови под­дер­живается на более высоком уровне про­должительное время. Лишь в случае легкой и среднетяжелой ней­­роинфекции, вызванной только слабо нейроинвазивными штам­мами ВКЭ, можно ожидать продолжительного проникнове­ния в мозг и медленной репликации вируса в клетках мозга внут­ри границ гематоэнце­фа­лического барьера. Можно предпо­ла­­гать, что при затяжном раз­витии нейроинфекции первона­чаль­ная вирусемия в перифери­ческой крови успевает подавляться, пер­вая лихорадка спадает и становится возможной новая волна ви­русемии в крови за счет репликации вируса в мозге и новая волна лихорадки у больного.

При этом дополнительно к временному фактору, связанному с преодолением гематоэнцефалического барьера вирусом, следует учитывать и фактор изменчивости генома ВКЭ. При репликации вируса в клетках ЦНС, в отличие от клеток висцеральных орга­нов, возможно, с большей вероятностью происходят мутации с об­разованием новых иммуногенных эпитопов белка Е и других белков у новых нейровирулентных штаммов ВКЭ. Как показано методом иммуноблотта [76], спектры выявляемых антител в лик­во­ре не совпадают со спектром антител в сыворотке крови боль­ных клещевым энцефалитом.

6.3. Иммунитет и цитопатические механизмы инфекции

До сих пор нет специальных публикаций по клиническому изу­­чению вирусемии, кинетики и механизма реакций клеточно-гуморального иммунитета ВКЭ-инфекции с генотипированием иммуноцитов и с анализом индукции цитокиновых медиаторов им­мунитета. Результаты более ранних исследований основных ас­­­пектов иммунного ответа при клещевом энцефалите были про­ана­лизированы в обзоре [14]. Было установлено, что на ранних стадиях инфекции ВКЭ репродуцируется в иммуноцитах и органах системы иммунитета и локализуется в них также в дальнейшем при персистентной инфекции. Выраженный тропизм персисти­рую­­щего ВКЭ к лимфоидным органам, длительная персистенция в ткани селезенки и лимфатических узлов при бессимптомной инфекции и хроническом энцефалите были показаны в экспе­риментах на обезьянах и сирийских хомячках.

При остром клещевом энцефалите относительное и абсолютное содержание Т-лимфоцитов в крови снижено. Дефицит Т-клеток выявляется уже в первые дни болезни и постоянно сохраняется в течение первых двух недель. Полная нормализация относи­тель­ного содержания Т-лимфоцитов происходит позже в период реконвалесценции инфекции через 3 месяца. Функция В-лим­фо­ци­тов при острой инфекции не нарушена. Отмечены активная про­ли­ферация В-клеток и 2-кратное повышение их содержания в пери­ферической крови с нормализацией к концу 3-го месяца. Из­бира­тельное поражение Т-системы иммунитета при остром кле­ще­вом энцефалите исследователи связывают с размножением ви­ру­са в тимусе. Глубина вирусиндуцированной депрессии Т-имму­ни­тета и ее продолжительность прямо коррелируют с тяжестью клиничес­кого течения острого клещевого энцефалита.

По сообщению [61], у пациентов с менингеальной формой клещевого энцефалита исследовался иммунный статус, и у боль­шин­ства выявлен вторичный иммунодефицит с преимущест­венным снижением количества лимфоцитов фенотипа СD3 и CD4.

Было показано, что цитотоксические Т-лимфоциты — CTL — разрушают зараженные вирусом клетки-мишени in vitro в от­­сут­ствие противовирусных антител и комплемента. Также име­ются сведения о выявлении активированных цитокинами естест­венных киллерных клеток — NK, активированных лимфокинами Т-лимфоцитов-киллеров — LAK. Выявлены К-клетки, отвечаю­щие за зависимую от специфических антител цитотоксичность. С помощью активированных макрофагов вирусный антиген предъ­яв­ляется В- и Т-лимфоцитам в иммуногенной форме. Мак­ро­фаги сек­ретируют иммунный интерферон — фактор, стиму­ли­рую­щий диф­ференцировку В-клеток в присутствии вирусного антигена. Эффекторные функции макрофагов, вирусспеци­фи­чес­ких антител обеспечивают разрушение вирионов и элиминацию из организма чужеродных антигенов. Однако, в зависимости от чув­ствитель­нос­ти к действию ферментных систем фагоцитов, штаммы ВКЭ де­лятся на 2 группы: первая — легко инактиви­рую­щиеся макро­фа­га­ми, вторая — резистентные к действию мак­рофагов; некото­рые вирусы второй группы способны к активной и длительной пер­систенции в макрофагах. Таким образом, мак­рофаги, персис­тентно инфицированные или являющиеся пермис­сивной системой для ВКЭ, как предполагается, могут способ­ствовать генерализации и сохранению вирусной инфекции в организме. В этом смысле макро­фагальный барьер как защитная система не всегда эффек­тивен. Как видим, и по отношению к мак­рофагам штаммы ВКЭ биологически неоднородны.

Отражением состояния активного функционирования В-си­с­темы иммунитета при острой инфекции служат показатели эксп­рессии вирусспецифических антител, в основном, против струк­турного Е антигена. Антитела класса IgM к ВКЭ выявляются с 4-го дня болезни, переключение синтеза ранних ан­тител IgM на противовирусные антитела класса IgG отмечается примерно на 21-й день с дальнейшим нарастанием титра по­след­них. Уровень антител IgM сохраняется высоким в течение 3-х месяцев, затем сни­жается, однако эти антитела могут вы­являться и спустя 3 го­­да у пациентов с персистентной хро­нической инфек­цией. У пациентов, выздоровевших после острой инфекции, ви­рус­нейт­рализующие антитела обычно сохраняются в течение деся­ти­летий, антигемагглютинины — 3–4 года, а комп­ле­мент­свя­зы­ваю­щие ан­­ти­тела — 1–6 лет. Титр антител в ликворе больных кле­ще­вым энцефалитом ниже, чем в крови, с коэффи­ци­ентом кор­ре­ля­ции, равным около 0,72. Предполагается локаль­ный синтез имму­но­глобулинов в мозге и фильтрация белков через поврежденный энцефалический барьер. В работе [76] показано, что ВКЭ-инфекция приводит к индукции гуморального иммунного ответа не только против структурных белков, но также сопоставимой индукции антител против неструктурных белков вируса как в крови, так и в спинномозговой жидкости больных клещевым энцефалитом. Однако, спектры выявляемых антител к вирусным белкам в лик­воре не совпадали с таковыми в сыворотке крови. По мнению автора, антитела к неструктурным белкам прежде всего могли индуцироваться в результате разрушения инфицированных клеток в ходе инфекции. Одновременно не исключается и секреция не­структурных белков инфицированными клетами. При этом анализ по­лученных данных не выявил корреляции между нали­чием ан­ти­тел, специфичных к индивидуальным вирусным белкам или груп­пе белков ВКЭ, и формой заболевания (лихорадочной, ме­нин­геальной или менингоэнцефалитической). В результате дела­ет­ся заключение о том, что специфические антитела не играют су­щественной роли в защите от инфекции.

Недостаточность гуморального иммунитета для защиты от кле­­щевого энцефалита подтверждается хорошо известными примерами вирусемии при высоких показателях гуморального иммунитета и заболеваемости людей, имеющих вирусспеци­фи­чес­кие антитела вследствие естественной иммунизации или в ре­зуль­тате вакцинации и ревакцинации. Также известны примеры по­вторного заболевания людей, перенесших клинически выра­жен­ные формы клещевого энцефалита с формированием постин­фекционного гуморального иммунитета [1]. Развитие хронического кле­щевого энцефалита, как и острой формы заболевания, проис­хо­­дит на фоне циркулирующих в крови и ликворе вирусспеци­фи­ческих антител. Из этого следует, что при клещевом энцефалите существуют механизмы, посредством которых ВКЭ избегает эли­ми­нирующего действия вируснейтрализующих антител и под­дер­­живает как репликативную, так и, несомненно, персистентную инфекцию.

Ключевое значение в защите организма на ранней стадии ин­фекции, по-видимому, имеет клеточный иммунитет. Поэтому про­гностически значимым для развития инфекции является Т-де­фицит и длительная циркуляция антител класса IgM, что может указывать также на нарушение функций эффекторов кле­точного иммунитета.

Репликация вируса в чувствительных, пермиссивных клетках в конце концов часто приводит к их гибели в результате цитопа­ти­­ческого действия вируса. Предполагается, что эти цитопати­чес­кие механизмы в инфицированной вирусом клетке лежат в основе цитодеструктивных патологических процессов патогенеза клещевого энцефалита. Выделяют 2 типа гибели инфицированных вирусом клеток — цитолиз и апоптоз. Первый связан с необрати­мым нарушением целостности клеточных мембран, с воспалитель­ными процессами и разрушением лизосом и аутолизом инфициро­ванной клетки. Инъекция МКА против белков Е и М и антител про­тив неструктурного белка NS1 в эксперименте защищает мы­шей от флавивирусного энцефалита [40],причем антитела эффек­тив­ны и на стадии нейроинвазии, тогда как пассивный перенос им­мунных клеток на этой стадии инфекции не имеет терапев­ти­чес­кого эффекта. В случаях тяжелой или летальной инфекции с активной вирусемией и антигенемией в высоких концентрациях развитие воспалительных реакций в критических органах и тка­нях осложняет патогенез и убыстряет гибель животных. Показа­но, что NK и CTL ответственны за лизис инфи­цированных нейро­нов и астроцитов. В этих процессах участвует интерферон-индуци­рованная экспрессия антигенов класса I и II главного комплекса гистосовместимости.

Второй цитоцидный механизм инфицированной вирусом клетки связан с наступлением ее физиологической смерти, вы­зван­ной запуском механизма запрограммированной гибели. Апоп­тозный некроз клетки начинается без нарушения целост­ности кле­точной мембраны [37]. Был изучен индуцированный вирусом апоптоз на моделях инфицированных ВКЭ культур клеток и но­во­рожденных мышей [38]. Опыты проводили с тремя штаммами ВКЭ: штамм 651, выделенный из крови больного лихорадочной формой клещевого энцефалита; штамм Пищелкин, выделенный из мозга больного, умершего от тяжелого клещевого энцефалита и штамм 155, выделенный из клеща I. persulcatus. Все три штам­ма вируса способны вызывать апоптоз путем олигонуклеосомной фрагментации ДНК клеток головного мозга двухсуточных белых мышей и клеток эмбриональной почки свиньи СПЭВ в результате репликативной вирусной инфекции. Сопоставление показателей титров ВКЭ с динамикой эндонук­леазной фрагментации ДНК клеток СПЭВ указывает на то, что формирование и накопление ин­фекционного вируса в клетке происходит до наступления гибели клеток. Это дает авторам основание считать, что апоптозный ци­­топатический эффект ВКЭ, наблюдаемый на клетках СПЭВ, является отражением ответной специфической реакции клетки-хозяина на вирусную инфекцию. В то же время 3 указанных штамма ВКЭ вызывают персистентную инфекцию на клетках Vero-E6 (перевиваемая клеточная линия почки зеленой мартыш­ки), в которых накопление вирусного антигена не сопровождается эндонуклеазной фрагментацией ДНК или какими-либо другими признаками цитопатической деструкции инфицированных клеток. Тот факт, что продуктивная инфекция при заражении разными штам­мами ВКЭ клеточной культуры Vero-E6 не сопровождается на­коплением инфекционного вируса и деструкцией клеток, может свидетельствовать о том, что персистентный или латентный ме­ха­низм вирусной инфекции в данном случае определяется гене­тическими свойствами клеток, в которых ВКЭ не индуцирует апоптоз.

В результате авторы делают вывод о том, что ВКЭ способен вызывать апоптозную, запрограммированную гибель клеток как in vivo, так и in vitro, которая, по-видимому, является одним из ме­­ханизмов цитопатического действия вируса в некоторых пер­мис­сивных клетках инфицированного ВКЭ организма. В другом сооб­щении авторы отмечают, что степень выраженности эндо­нук­­леазной фрагментации клеточной ДНК при апоптозе в большей мере соответствовала динамике накопления вирусного антигена, чем вирусной РНК [55].

Еще в 60–70-х годах прошлого века были описаны новые «про­межуточные» антигены, появляющиеся в мозге инфициро­ван­ных ВКЭ животных и в сыворотке крови больных, отличные от антигенов вируса и нервной ткани. Антитела к неоантигенам вы­являлись с наибольшей частотой в стадии неуклонного прогрес­сирования инфекции, предшествующей развитию прогредиентного течения заболевания. Считается, что новые антигенные субстан­ции, обладающие выраженными аллергическими свойствами, играют роль при трансформации острого клещевого энцефалита в хроническую инфекцию.

Очевидно, патогенетическими факторами ВКЭ-инфекции, кроме прямого цитопатического действия репликативной вирусной инфекции, служат также цитопатические механизмы клеточного иммунитета с участием CTL и вирусиндуцированного апоптоза. В то же время, эти факторы наравне с вирусспецифическими ан­­ти­телами, несомненно, ускоряют элиминацию возбудителя ин­фекции, и без сочетанного действия клеточно-гуморального имму­нитета едва ли возможно выздоровление. Не исключено, что ин­дукция антител гуморального иммунитета не всегда эффективно со­четается с развитием клеточного иммунитета. По-видимому, в поль­зу такого предположения говорит выше отмеченное клини­ческое наблюдение: наиболее высокие титры гуморальных антител выявляются только у больных клещевым энцефалитом в тяжелой очаговой форме [31, 32].

6.4. Патоморфология нейроинфекции острого
и хронического клещевого энцефалита

Патологический процесс в нервной системе при остром кле­щевом энцефалите носит чрезвычайно диффузный характер [14]. Поражаются оболочки головного и спинного мозга, буквально все отделы ЦНС, включая серое и белое вещество, корешки и пери­ферические нервы. Процесс можно определить как менинго-энцефало-миело-радикуло-неврит или панэнцефалит по Кролю. Од­­нако, характер, частота и интенсивность поражений различных отделов ЦНС неодинаковы. В первую очередь, постоянно и более тяжело поражается шейный отдел спинного мозга, особенно перед­ние рога. Менее тяжелым считается воспалительный процесс в области варолиева моста, продолговатого и среднего мозга. По­стоянны, хотя и не всегда одинаковы по силе и распростра­не­нию изменения в двигательных ядрах продолговатого мозга и ва­ролиева моста, черного вещества Зоммеринга, в красных ядрах, центрального серого вещества в области сильвиева водопровода. Из всех образований стволовой части мозга особо выделяется по­стоянство и сила поражений нижней оливы. Воспаление расп­ро­страняется также на дорсальные и вентральные отделы ствола. Далее по выраженности воспалительных изменений следуют про­ме­жуточный мозг и подкорковые узлы, а также кора мозжечка. На­конец, наименее выражен и наименее постоянен патологи­чес­кий процесс в коре головного мозга. Снижение ин­тен­сивности пора­жений происходит и в сторону поясничного отдела спинного мозга.

Локализация патологического процесса при хроническом кле­щевом энцефалите характеризуется еще большей диффуз­ностью, чем при острой инфекции. Причем процесс может распро­стра­нять­­ся как в оральном направлении в сторону коры головного моз­­га и в самой коре, так и в сторону поясничного отдела спин­но­­­го мозга, а также на образования ЦНС, которые не были пора­жены в период острой инфекции. Из той или иной комбинации поражений в выше отмеченных структурных образованиях мозга и складывается топография патологии в нервной системе больных хронической ВКЭ-инфекцией.

В случае хронического клещевого энцефалита у Чумакова посмертное исследование его мозга было проведено спустя 56 лет после первоначального инфицирования вирусом [49]. Изучены 18 участков головного и спинного мозга, селезенка, печень. В ЦНС выявлен вялотекущий, хронический прогрессирующий поли­морфный процесс. Он представлял комбинацию последствий острой стадии клещевого энцефалита, хронического клещевого энцефа­лита, вторичных неспецифических и возрастных изме­не­ний. Осо­бенно тяжелые изменения были в передних рогах шейного отдела спин­ного мозга, где наблюдалось почти полное отсутствие мото­ней­ронов, выраженный глиосклероз. Тяжелые изменения обнару­жены в среднем мозге, варолиевом мосту, подкорковых узлах, мозжечке, продолговатом мозге. Кора головного мозга хорошо со­хранена. В правой двигательной коре методом ПЦР выявлена РНК ВКЭ. Инфекционный вирус не был выделен методами экс­плантации ткани и пассажей на сосунках белых мышей и клетках СПЭВ, HeLa, RH. И вирусный антиген не опре­делен методами ИФА и МФА. В 1985 и 1993 гг. методом ИФА в сыворотке кро­­­ви выявлены антитела класса IgG к ВКЭ в титре 1:1280. Спе­цифические IgM не найдены.

Характер альтерации в нервной системе при остром кле­щевом энцефалите описывается как массовое выпадение нервных клеток в первые дни заболевания. Оставшиеся нейроны в зоне по­ра­жений находятся в различных состояниях набухания, расп­лавления, распада, кариоцитоза, пикноза и гиперхроматоза. В условиях хронической инфекции наблюдаются все те поражения, что и при острой инфекции. Можно говорить лишь о том, какой вид поражений в клетках превалирует. При хронической инфек­ции наиболее распространенные и типичные изменения в нервных клетках — это их сморщивание и хроматолиз — дезинтеграция микроскопических белковых образований в нервных клетках. Уже в острый период воспалительные изменения в мозговой ткани не всегда тождественны. В большинстве случаев они характери­зу­ются экссудативно-пролиферативными явлениями. Однако, иногда воспалительная реакция в ткани мозга протекает атипич­но, при полном отсутствии продуктивных и экссудативных компо­нен­тов воспаления, когда периваскулярная инфильтрация нич­тожна. Нигде в мозговой ткани не наблюдается распростра­нения воспалительного инфильтрата. Воспалительный процесс выражен в виде узелков микроглиальной пролиферации. В отношении этих случаев особенно подчеркивается несоответствие между тяжестью клинического течения и слабой выраженностью воспалительных реактивных явлений при наличии резких дегене­ра­тивных из­ме­не­ний мозговой ткани. Именно эти случаи отличаются наиболь­шей тяжестью течения клещевого энцефалита.

Однако, в большинстве случаев острой инфекции наблюдают­ся выраженные экссудативные изменения, прежде всего тяжелые расстройства кровообращения в виде резкой гиперемии и стазов в мелких сосудах и капиллярах, а также кровоизлияний путем миг­рации клеток через стенки кровеносных сосудов в ткани. Стен­ки сосудов отечные, набухшие. Эндотелий сосудов с признаками набухания и пикноза — конденсации ядра клетки, сопровождаю­щейся его сморщиванием в гиперхромную плотную массу. Места­ми сосудистая стенка некротизирована, что повышает ее прони­цае­мость. Расстройство кровообращения сопровождается интен­сив­ным серозным отеком мозговой ткани вокруг вен разных калибров. Клетки микроглии, олигодендроглии и полиморфно-ядер­ные лейкоциты на ранних сроках образуют также очаги нейронофагии. Нередки явления выраженного разрушения клет­ками микроглии дендритов, образующих синапсы нейронов. Эти некробиотические изменения экто- и микроглии являются пока­за­телем токсичности процесса. В острой инфекции в стенках и по ходу сосудов периваскулярно, а также вне сосудов в ткани моз­га наблюдаются значительные клеточные инфильтраты из лим­фо­идных клеток, полибластов, полиморфно-ядерных лейкоци­тов и немногочисленных плазматических клеток.

В дальнейшем, в период еще острого заболевания, воспали­тель­­ные явления вокруг сосудов постепенно угасают. Изменяется также клеточный состав инфильтрата. Происходит распад и исчез­но­­вение полиморфно-ядерных лейкоцитов. Количество плазмати­ческих клеток заметно нарастает при преобладании в инфильтрате лимфоидных клеток. Наряду с клеточной инфиль­тра­цией гемато­генного происхождения в ЦНС больных уже в ранние сроки ин­фек­ции наблюдается пролиферация клеток внешней стенки сосудов и глии. Разрастание клеток микроглии и олигодендроглии носит очаговый и диффузный характер.

Как показывают результаты электронно-микроскопических исследований ЦНС у больных, для острого периода инфекции ха­­рак­терны локализация и репродукция вируса, в основном, в нервных клетках. Процесс репликации вируса сопровождается распадом и редукцией органелл клеток с выраженной гиперплазией гладких мембран, вакуолизацией и везикулизацией цитоплазмы. По мере завершения сборки вирусов в органеллах нервных клеток происходят тяжелые деструктивные изменения с распадом ядерной и плазматической мембраны, выходом остатков органелл и вируса в межклеточное пространство.

Тяжелые изменения с отеком, распадом и расплавлением ультраструктур наблюдаются также в клетках глии, безмякотных и миелинизированных волокнах, в клетках воспалительного ин­фильтрата, макрофагах, лимфоцитах, стенках сосудов, что в итоге приводит к полной дискомплексации ткани в очаге пора­же­ния. Патологические изменения в нейронах и окружающих их тка­не­вых элементах (глия, клетки воспалительного инфиль­трата, от­рост­­ки, стенки сосудов) возникают одновременно в ранние сроки инфекции и развиваются параллельно.

Морфогенез вируса происходит следующим образом: нуклео­тиды вируса локализуются на мембранах эндоплазматической сети и частично в цитоплазматическом матриксе нервных клеток. Морфологически зрелые вирионы отпочковываются с мембран в резервуары эндоплазматической сети, пластинчатого комплекса, в вакуоли и везикулы. Вокруг электронно-плотного нуклеоида зре­лого вириона хорошо выражена белковая суперкапсидная оболочка.

В экспериментальных исследованиях у обезьян с хронической формой клещевого энцефалита, как и у людей, наблюдается пер­сис­тенция вируса. Находки вирулентного инфекционного вируса редки. При этом хронический клещевой энцефалит в поздние сроки имеет существенные патоморфологические и патогенети­чес­кие особенности по сравнению с острой инфекцией. Различия заключаются, прежде всего, в отсутствии воспаления, клеточных инфильтратов и пролифератов клеток, гиперемии при наличии распространенных альтеративных изменений в клеточных и межклеточных элементах нервной системы, резком отеке ткани мозга. При этом отсутствует активная репродукция вируса и выяв­ляются немногочисленные вирионы с измененной суперкап­сид­ной оболочкой в цитоплазме нейронов и межклеточных про­странствах. Патогистологический процесс носит дегенератив­ный, а не воспалительный характер, как при острой инфекции.

По результатам изучения 37 летальных случаев клещевого эн­цефалита у людей авторы работы [60] отмечают, что выражен­ность альтеративной компоненты воспаления и связанной с ней тяжести повреждения нейронов, наиболее часто вовлекаемых при клещевом энцефалите структурах ЦНС, а также инфильтративно-пролиферативная компонента патологического процесса имеют относительную зависимость от клинических проявлений заболе­вания. Среди особенностей реакции мозговой ткани при воздей­ст­вии вируса отмечается ранняя пролиферация микроглии, кото­рая является разновидностью макрофагов. Выраженность ее зависит от степени повреждения нейронов. При бурно протекающей инфекции (3–10 суток) в мозге преобладают сосудистые расстрой­ства при почти полном отсутствии околососудистых инфиль­тратов. В более поздние сроки (до 30 суток) нередко инфильтра­тивная реакция слабо выражена, и лишь в 1/3 случаев имеются при­васкулярные муфты из мононуклеарных клеток. Это указывает на то, что заболевание часто развивается при вирусиндуцированном подавлении воспалительных реакций клеточного иммунитета в ткани мозга, что непосредственно отражается на клинико-мор­фологических особенностях дальневосточного варианта клещевого энцефалита.

6.5. Экспрессия антигенов НLA-комплекса
и гуморальный иммунитет ВКЭ-инфекции

Праймированные вирусным антигеном цитотоксические Т-лим­фоциты — CTL — и хелперные Т-лимфоциты — Th — свои эффекторные функции могут выполнить только в том случае, ес­ли соответствующий антигенный вирусный эпитоп для свя­зы­ва­ния с Т-клеточным рецептором презентируется на поверхности ин­фицированных клеток или лизогенных макрофагов в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости НLA. Та­кая рестрикция клеточных взаимодействий осуществляется посред­ством антигенов НLA, гены которого расположены в 6-ой хромо­соме человека. Три локуса антигенов класса I в геноме че­ловека обозначены как HLA-A, HLA-B и HLA-C, а три локуса ан­тигенов класса II — HLA-DP, HLA-DQ и HLA-DR. Локусы пред­ставляют собой комплекс многих тесно сцепленных между собой генов, каж­дый из которых имеет множество аллельных вариантов. Ал­лельные вариации генов молекул HLA и их ха­рак­тер­ные сочетания у каждого индивидуума определяются наследст­вен­ностью и уни­каль­ны. В настоящее время нет возможностей определить, почему из неограниченного числа аллелей молекул НLА те или иные молекулы преимущественно участвуют в меха­низ­ме антигенной рестрикции межклеточных взаимодействий кле­точно-гуморального иммунитета инфекции. Поэтому на данном этапе ис­следований вли­я­ние наследственного фона на развитие имму­ни­тета ограни­чивается выявлением ассоциативной связи между экспрессией тех или иных молекул НLА на лимфоцитах индиви­дуу­мов с харак­терными особенностями развития иммунитета и инфекции в целом у обследуемых.

Ранее была обнаружена иммуногенетическая ассоцииро­ван­ность HLA-антигенов с предрасположенностью или резистент­ностью к заболеванию клещевым энцефалитом после укуса виру­со­форным клещом, с благоприятным или неблагоприятным исхо­дом клещевого энцефалита. Далее ассоциированность HLA-анти­ге­нов класса I с уровнем противовирусных антител и сывороточных иммуноглобулинов основных классов (IgM и IgG) была изучена у 97 больных клещевым энцефалитом в лихорадочной и других фор­мах с поражением оболочек и/или вещества головного и/или спинного мозга при иммунологическом и иммуно­генети­чес­ком обследовании [39].

Сравнительный анализ динамики и уровня синтеза специфи­ческих и общих антител класса IgM и IgG в группах больных выявил раз­личную ассоциированность HLA-антигенов с этими процес­са­ми. Во-первых, одни из этих антигенов или их сочетания друг с другом ассоциировались с высокой положительной ди­намикой гуморального иммунного ответа на ВКЭ: антигены HLA-A10, -7, B12, межлокусные сочетания HLA-антигенов А2/В7, А2/В12, A3/B7, A3/B12, A10/B7 для специфических IgM; антигены HLA-A2, -B12, -B16, -B18, -B35, внутри- и межлокусные соче­та­ния антигенов A2/B12, A3/B12, A2, 9 для специфических IgG. Другие антигены и их комбинации: A1, B5, B18, B/40, В2/B18, A2, 28 для антител класса IgM и HLA-A11, A-15, B40, Cw3, -A11/B7 для специфических IgG-антител — ассоциировались с более низкими уровнями иммуноглобулинов при специфическом иммунном ответе на ВКЭ.

Во-вторых, антигены, ассоциированные с высокими уровнями иммуноглобулинов, «предопределяли» и более быстрое достижение их максимальных значений в крови. Так, средние титры специ­фи­­ческих антител класса IgM в группах больных, позитивных по данным антигенам, достигали максимальных значений 9,3–9,8 log в основном до 21-го дня болезни. В противоположной группе максимальные титры IgM были в пределах 8,7–8,8 log и до­с­тигались после 21-го дня. Та же тенденция сохранялась и при накоплении специфических антител класса IgG; макси­маль­ные значения антител IgG, равные 8,5–9,0 log и 8,0–8,2 log, до­сти­гались в оппозитных группах к 28–35-му и 35–42-му дню бо­лезни, соответственно.

В-третьих, определенные антигены, например, HLA-B12, и особенно его сочетания с HLA-A3 (A3/B12), ассоциировались не только с интенсивной продукцией антител IgM, но и с задержкой ее переключения на синтез антител IgG (такое переключение про­исходило лишь к 35–42-му дню болезни). В течение болезни в крови больных увеличивалось содержание не только специ­фи­ческих антител, но и сывороточных иммуноглобулинов основных классов. Анализ уровня сывороточных иммуноглобулинов у боль­ных клещевым энцефалитом в процессе заболевания также выявил их ассоциированность с определенными HLA-маркерами. Напри­мер, молекула HLA-B7 ассоциирована с высоким уровнем IgM и IgG. Межлокусное сочетание HLA-антигенов A10/B7 ассоции­ро­вано с высоким уровнем сывороточных IgM, а антигены HLA-A2 и HLA-B16 — с сывороточными IgG. Антиген HLA-Cw3 ассоции­ро­вался с низким уровнем сывороточных иммуно­гло­бу­ли­нов ос­нов­ных классов, комбинация антигенов A2/B18 — с низ­ким уров­нем IgM, а антиген HLA-A3 — с низким уровнем сы­воро­точных IgG. Различия между оппозитными по HLA-фе­но­типу группами были наиболее выражены в острой фазе инфекции (на 7–14 день болезни).

Л.О. Черницына с соавторами также показали, что клини­чес­кий полиморфизм клещевого энцефалита в значительной мере определяется индивидуальными особенностями иммунной системы организма, что проявлялось в тесной ассоциированности с аллель­ными вариантами генов главного комплекса гистосовместимости: у больных с одинаковыми клиническими проявлениями кле­ще­во­го энцефалита достоверно чаще встречались определенные ал­лель­ные варианты генов HLA-комплекса. Достоверно позитивные ассоциативные связи у больных клещевым энцефалитом выявлены для следующих HLA-фенотипов: A2/B18, A9/B16, A9/B21, A28/B12, A2, 2, B5, 16. Антиген А10, а также фенотип A3/B5 определяют высокий риск развития клещевого энцефалита с поражением оболочек и вещества головного мозга, а антиген B40 и такие фенотипы, как A1/B5, A1/B18, A3/B40 ассоцииро­ва­ны с лихорадочной формой заболевания. Антигены А10, А11, а также фенотипы A10/B7, A10/B16, A11/B7, A11/B35, A2, 10, A3, 11 определяют предрасположенность к развитию двух­вол­нового течения заболевания клещевым энцефалитом. Выявле­на группа фенотипов, играющих защитную роль: A1/B35,
A9/B27, A2, 19, B35/40. Также были установлены достоверные различия напряженности гуморального иммунного ответа у боль­ных с разными клиническими формами и вариантами течения клещевого энцефалита: тяжесть клинического течения болезни кор­­релирует с характером и динамикой синтеза специфических иммуноглобулинов основных классов. На основании выявленных закономерностей авторами предлагаются новые подходы к про­гно­зированию эффективности лечения и профилактики клещевого энцефалита на популяционном уровне [50, 51].

По существу, к аналогичным заключениям об ассоциирован­нос­ти молекулярно-генетических маркеров пациентов с особеннос­тя­ми персистентной инфекции приходят авторы работы по клини­ческому изучению гепатита С, вызываемого также одним из флави­вирусов семейства Flaviviridae. Высокие показатели диагностичес­кого коэффициента в ряде случаев на основании изолированных иммуногенетических критериев позволяют с известной степенью достоверности прогнозировать наиболее вероятный вариант клинического течения инфекции [75].

Следует подчеркнуть, что ассоциативную связь наследствен­ного фактора пациентов с проявлением различных клинических форм клещевого энцефалита удается установить несмотря на оче­вид­ную гетерогенность патогенгетических свойств клещевого пула ВКЭ. Из этого следует, что та или иная клиническая форма кле­­щевого энцефалита реализуется в результате хорошо сбалан­си­­рованного взаимодействия организма с патогеном. В инфек­ци­он­ном процессе наиболее полно используются полипотентные за­щит­ные возможности иммунной системы пациента при инфи­ци­ро­вании организма штаммами вируса различной патогенности. По-видимому, механизм рестрикции межклеточных взаимодейст­вий оптимального гуморально-клеточного иммунитета при обра­зо­вании презентируемого инфицированными клетками или активи­рованными макрофагами комплекса гистосовместимости включает конкурентный отбор необходимых антигенов HLA из множества их вариантов с учетом степени токсической, висцерально- или ней­­ропатогенной активности антигена ВКЭ, экспонируемого в ком­п­лексе для связывания рецепторов эффекторных Т- или В-лим­фоцитов. Гетерогенными свойствами возбудителя инфекции и адекватно вариабельным алгоритмом развития иммунного ответа, возможно, объясняется чрезвычайное разнообразие тече­ния нейровисцеральной инфекции в инаппарантной, стертой субкли­нической, лихорадочной, менингеальной, очаговой формах. Бо­лее того, благодаря вариабельности иммунного ответа организ­ма на особенные биологические свойства возбудителя клещевой энце­фалит может развиваться также в режиме одно- и двухвол­новой острой инфекции или в форме прогредиентного и хрони­ческого энцефалита.

6.6. Развитие общей концепции патогенеза клещевого энцефалита и прогноз исхода инфекции

Особенность патогенеза клещевого энцефалита, в общем слу­чае, связана с наличием висцеральной и невральной фаз инфекции. Тем не менее, часто ВКЭ-инфекция ограничивается только экстра­нев­­ральной фазой. Сюда относятся частые случаи инаппарантной и субклинической, стертой лихорадочной форм инфекции с естест­вен­ным формированием иммунного статуса у подавляющего боль­шинства населения, постоянно проживающего на территориях природных очагов клещевого энцефалита. Как подчеркивается при этом, у людей с установившимся иммунным статусом к
ВКЭ-ин­­фекции, не остается никаких признаков вовлечения в ин­­фек­цию ЦНС. Развитие иммунных процессов только в экстра­нев­раль­ной стадии составляет также основу активной вакцинопро­фи­лактики этой инфекции. Однако, выраженность менингеаль­ной, очаговой симптоматики у больных и последствия инфекции с поражением определенных отделов ЦНС не оставляют сомнения в том, что манифестная инфекция клещевого энцефалита во мно­гих случаях не ограничивается висцеральной фазой.

Очевидно, развитие более сложной висцерально-невральной инфекции в каждом отдельном случае может быть связано как с присутствием особо нейровирулентных штаммов в клещевом пуле вируса, так и с дефицитом системы клеточно-гуморального имму­нитета пациента. Гетерогенность генома и патогенных свойств ВКЭ широко обсуждались в настоящем обзоре. С другой стороны, неадекватный иммунный ответ организма с развитием вторичного иммунодефицита на висцеральном этапе инфекции, по-видимому, может спо­соб­ствовать развитию инфекции также в ЦНС. В про­цессе ин­фек­ции иммунопатогенный штамм вируса как бы помогает об­хо­дить иммунный барьер нейроинвазивным, нейровирулентным штаммам из кле­ще­вого пула вируса. Как бы то ни было, особен­нос­ти иммуно- и ней­ро­патогенеза клещевого энцефалита, в первую очередь, связаны с характером взаимодействия гетерогенного моле­кулярно-гене­ти­ческого клещевого пула ВКЭ на территории с им­мун­ной системой пациента с ее индивидуальными иммуногенети­ческими особен­нос­тями. О том, что течение острой и, возможно, хронической инфекции тоже в зна­чительной мере детермини­ровано со стороны макроорганизма, подтверждают приведенные выше результаты изучения ассо­ции­ро­ванности проявления серологи­чес­ких показателей, различных клинических проявлений инфек­ции у больных с экспрессией опре­де­ленных антигенов НLA комп­лекса гистосовместимости.

Наличие двух патогенных фаз развития инфекции характерно и для других флавивирусных инфекций. Например, в инфекции, вы­зы­ваемой вирусом желтой лихорадки, быстрое развитие висце­раль­ной фазы приводит к гепатиту, а невральной — к энцефалиту. При этом в значительном большинстве случаев сложная висце­раль­­но-невральная инфекция желтой лихорадки или клещевого энцефалита заканчиваются выздоровлением. Таким образом, наи­бо­­лее частый исход сложной нейровирусной инфекции, как и в слу­­чае только висцеральной — выздоровление больного и дос­ти­же­­­ние иммунного статуса. Из этого следует, что развитие, купиро­ва­­ние инфекции, стадия реконвалесценции и становление им­мун­­ного статуса сложной сочетанной висцераль­но-невральной инфек­ции клещевого энцефалита также предусмат­ри­ваются естест­венным алгоритмом развития острой циклической нейровирусной ин­фекции.

В общем вирусоиммуногенетическом представлении патоге­не­за клещевого энцефалита пока еще не определены место и роль тяжелой вторичной иммунопатологии, персистенции и инте­гра­­ции вируса в острой и хронической инфекции. То, что с нети­пич­­ным (неоптимальным) развитием острой инфекции связаны необ­ра­тимое осложнение острой ВКЭ-инфекции или ее трансфор­ма­ция в хронический клещевой энцефалит, пока можно только пред­по­ла­гать. Также можно предполагать, что реакция иммунной сис­те­мы индивидуумов с клещевым пулом вируса с особыми неод­нород­ны­ми свойствами приводит к необычному алгоритму острой цикли­ческой инфекции — двухволновому клещевому энцефалиту.

Клинически манифестная острая циклическая инфекция кле­ще­вого энцефалита, как и другие острые вирусные инфекции, на­чи­­нается с инкубационного периода, развивается в стадии ост­рой висцеральной или сочетанной висцерально-невральной инфекции разной продолжительности и, как правило, завершает­ся элимина­цией вируса, выздоровлением больного и установлением иммунного статуса. Весь этот наиболее часто наблюдающийся процесс проте­кает по определенному естественному алгоритму острой инфекции взаимодействия иммунной системы человека с вирусом, вырабо­тан­ному организмом эволюционно при регулярных внедрениях чужеродных антигенов вирусной природы в течение всего времени становления вирусных инфекций. Предпола­гае­мый алгоритм ост­рой инфекции состоит из определенных этапов или стадий инфек­ции, развития иммунитета, последовательности основных процес­сов патогенеза в целом. Основные стадии инфекции в виде инку­ба­ци­он­ного периода, клинически манифестной стадии острой ин­фекции с развитием кле­точ­но-гуморального иммунитета и стадии ре­конвалесценции с полной элиминацией вируса из организма ха­рак­терны для острых циклических инфекций. Однако, алгоритм конк­ретной вирусной инфекции содержит частные особенности, свя­занные с молекулярно-генетическими, функциональными раз­ли­чиями, клеточным и тканевым тропизмом возбудителя ин­фек­ции. С учетом этих особенностей необратимые осложнения острой инфекции, трансформация в хроническую инфекцию у па­­циента и, тем самым, выпадение стадии реконвалесценции воз­ни­кают как результат определенного отклонения от устано­вив­ше­гося ал­го­ритма развития защитного иммунитета острой цикли­ческой ин­фекции.

В настоящее время развитие клинических лабораторных ме­то­дов анализа позволяет проследить за изменением концентрации вирусологических маркеров, антигенных и геномных; за экспрес­сией HLA-антигенов в комплексе с вирусными антигенами; за индукцией иммунологических маркеров и факторов клеточно-гуморального иммунитета — вирусспецифических иммуноглобу­ли­нов класса IgM и IgG; хорошо известных иммунорегулирующих, иммуномодулирующих и провоспалительных, апоптозных цито­кинов (интерферонов, интерлейкинов, ФНО и других сывороточ­ных факторов); проследить за активацией, пролиферацией и дина­микой численности эффекторов клеточного иммунитета: клонов цитотоксических и хелперных Т-лимфоцитов, антителосин­тези­рующих В-лимфоцитов и плазматических клеток, макрофагов, NK- и К-клеток. Сюда следует присоединить также результаты часто проводимых биохимических анализов и других современных инструментальных клинических исследований пациента. Последо­ва­тельным сопоставлением динамики объективных данных лабо­ра­торного анализа с результатами других клинических исследо­ваний и наблюдений за состоянием пациента можно установить ста­дии развития острой циклической инфекции с учетом смены ее клинических фаз: продромы, острой фазы инфекции с развитием клеточно-гуморального иммунитета, ранней и поздней реконвалес­ценции. Природный алгоритм выздоровления может быть описан установлением уровня индукции основных генетических и анти­генных вирусологических, иммунологических, иммунометричес­ких, цитокиновых, биохимических и др. маркеров острой инфек­ции на определенных стадиях развития репликативной и персис­тентной инфекции клещевого энцефалита. Динамика основных мар­керов инфекции может быть описана с учетом клинических особенностей лихорадочной, менингеальной или менингоэнцефа­ли­тической очаговой форм острого клещевого энцефалита. Сфор­мулированный таким образом алгоритм острой инфекции позволит проследить за размножением возбудителя, установить параметры оптимального развития клеточно-гуморального защитного имму­ни­тета с дифференциацией антительного, воспалительного и апоп­тозного компонентов эффекторных реакций, проследить за нейтра­ли­зацией и последующей элиминацией возбудителя из организма, проследить за становлением иммунного статуса по результатам дина­мического лабораторного обследования пациентов.

В результате лечащий врач еще в ходе инфекции может сво­е­временно сформулировать благоприятный прогноз исхода ин­фек­ции на основании характера реализации обобщенного алгорит­ма острой циклической инфекции. Примерно такой аналитический подход был использован при обзоре литературы по гепатиту В [71]. С учетом опубликованных результатов клинических и экспе­риментальных лабораторных исследований гепатита В был сфор­му­лирован примерный алгоритм патогенеза острого гепатита В из пяти стадий.

При комплексном лабораторном обследовании больного могут быть заранее выявлены характерные отклонения от оптимальных параметров индукции основных маркеров инфекции, ведущие к на­рушению алгоритма острой инфекции. В перспективе со време­нем динамика основных вирусологических и иммунологических маркеров ВКЭ-инфекции будет широко изучаться с применением новых количественных методов иммуноферментного и ПЦР анализов. Клиническими лабораторными исследованиями будут охвачены не только острая циклическая инфекция, но также и расп­ространенные случаи тяжелого необратимого осложнения острой инфекции, ее постепенной трансформации в хроническую инфекцию. Более детально станут изучаться факторы, ведущие к обострениям хронического клещевого энцефалита. На основе текущего анализа результатов лабораторного определения комп­лекса маркеров инфекции в динамике у лечащего персонала может сложиться более полное представление о развитии острой цикли­ческой инфекции, о вероятности развития тяжелой, необратимой острой инфекции или о начале развития пролонгированной или хро­нической инфекции клещевого энцефалита у пациента. В ре­зуль­тате, объективно обоснованное прогнозирование осложнения ин­фекции может помочь лечащему врачу в своевременном назна­чении больному необходимого этиотропного лечения. Лаборатор­ное обследование пациентов методами ИФА и ПЦР-анализа во время лечения больного и его выздоровления также целесообразно для контроля за эффективностью назначенного курса лечения.

7. Методы и средства лабораторной диагностики клещевого энцефалита
и их применение в клинической практике

7.1. ИФА Е антигена ВКЭ и антител к нему

Для выявления инфицирования вирусом и установления диаг­ноза клещевого энцефалита повсеместно используются лабо­раторные методы иммуноферментного анализа антигенов ВКЭ и антител к ним в сыворотке крови пациента. Анализ Е антигена ВКЭ также часто используется для определения инфицирован­нос­ти клеща, снятого с укушенных. Эти анализы основаны на реак­ции взаимодействия антиген — антитело с применением мече­ных ферментом антител для индикации результатов. В качестве приме­ра ниже приводятся краткие описания иммуноферментых тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» для клинического лабораторного анализа вирусного антигена и антител к ВКЭ.

ИФА Е антигена ВКЭ. Тест-система предназначена для выяв­ления ВКЭ в клещах и ликворе человека или животных и может быть использована в клинических и эпидемиологических иссле­до­ваниях.

В наборе реагентов тест-системы фирма поставляет готовые для проведения анализа стрипированные планешеты с предвари­тель­но иммобилизованными антителами. Одностадий­ный анализ антигена состоит в совместном инкубировании иссле­дуемого об­разца с конъюгатом моноклональных антител про­тив Е антигена ВКЭ с пероксидазой в лунках стрипов с пред­ва­рительно им­мо­би­ли­зованными антителами против ВКЭ. Реакционная смесь в лун­ках выдерживается во влажной камере 3 ч при 37°С или 16–20 ч при комнатной температуре. После удаления и промывки лунок от не связавшихся реагентов вирусный антиген в иссле­дуемой пробе проявляется реакцией ферментного конъюгата с субстратом, дающим окрашенный раствор в течение 25–30 мин при комнатной температуре. Оптическая плотность субстрата, оп­­ре­деляемая спект­рофотометрически, пропорциональна кон­цен­т­рации анали­зируемого вирусного антигена. В наборах тест-систем от «Вектор-Бест» по желанию заказчика в качестве субстрата пе­­рок­сидазы поставляются ОФД или ТМБ.

ИФА антител класса IgМ к ВКЭ. Для анализа используются го­­товые к применению пластиковые планшеты или стрипы с пред­варительно иммобилизованными антителами к IgM человека. Об­разец исследуемой стократно разведенной сыворотки инкуби­руется в течение часа при 37°С в лунках планшеты с антителами к IgM человека для связывания суммарной фракции антител клас­са IgM из анализируемой сыворотки. По окончании времени инкубации не связавшиеся компоненты сыворотки удаляются, и планшета промывается. Для связывания с вирусоспецифическими антителами IgM на планшете антигенов ВКЭ и меченых антител про­водится вторая инкубация планшеты с предварительно сме­шан­ным реагентом антигенов ВКЭ и конъюгатом МКА к ВКЭ с фер­ментом-пероксидазой при тех же условиях. После второго уда­­­ления и промывки не связавшихся компонентов наличие спе­ци­фических антител класса IgM к ВКЭ в исследуемой сыворотке определяется последующим проявлением активности и измерением оптической плотности окрашенного субстрата конъюгированного фермента.

Тест-система укомплектована контрольными сыворотками и всеми реагентами, готовыми для работы, снабжена соответст­вую­­щей инструкцией по применению.

ИФА антител класса IgG к ВКЭ. По желанию заказчика тест-­системы комплектуются готовыми к работе планшетами или стрипами с заранее иммобилизованным антигеном ВКЭ. В соот­вет­ствии с инструкцией разбавленная в 100 раз исследуемая сыво­рот­ка вносится в лунки планшеты с вирусным антигеном и инку­бируется в течение часа при температуре 37°С. В конце инкубации не прореагировавшие компоненты сыворотки удаляются, и план­шета промывается. Затем в лунки со связавшимися антителами вносится раствор ферментного конъюгата с моноклональными ан­ти­телами против иммуноглобулинов класса IgG человека. План­шета с реагентами выдерживается во второй раз в течение часа при 37°С. После удаления и промывки не связавшихся реа­гентов количество вирусспецифических IgG в исследуемой сыворотке опре­деляется последующим проявлением и измерением оптической плотности окрашенного субстрата ферментного конъю­гата в лунках планшеты. Набор реагентов тест-системы и ее инст­рукция по применению предусматривают процедуру титро­вания вирусспе­ци­фических IgG в сыворотке.

Тест-система выпускается в соответствии с требованиями ВФС 42-3503-99 и ее производство сертифицировано как меди­цин­ского иммунобиологического препарата.

7.2. ПЦР-анализ РНК ВКЭ

Методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с ПЦР геномная РНК ВКЭ определяется с применением молеку­ляр­ных зондов — меченых фрагментов нуклеиновой кислоты, комп­­лементарных к определенным участкам генома ВКЭ. Преи­мущества анализа РНК ВКЭ перед методом биопробы и анализом антигенов вируса иммуноферментным методом или методом флюо­рес­цирующих антител стали очевидными с первых работ по выяв­лению РНК ВКЭ еще простым методом гибридизации нуклеино­вых кислот [27, 28].

Первые результаты анализа РНК ВКЭ показали, что метод мо­­­лекулярной гибридизации — более высокочувствительный тест: вирусная РНК выявлена из 50,9% исследованных проб крови боль­ных с острым течением клещевого энцефалита. При исследо­вании тех же образцов крови методом биопробы на беспородных белых мышах инфекционный вирус выявлен в 23,4% случаев. По мнению авторов, столь значительное расхождение в резуль­татах анализов в сыворотке объясняется возможной маскировкой инфекционного вируса за счет формирования иммунных комп­лексов. В процессе депротеинизации при выделении РНК из ана­ли­зируемого образца нуклеопротеиновые комплексы диссоции­руют, и освобождающаяся вирусная РНК увеличивает частоту положительных результатов гибридизационного анализа. Более частое выявление РНК ВКЭ в крови больных может быть обу­слов­лено также значительно более активным, чем репликация инфекционных вирионов, синтезом вирусной РНК в инфици­ро­ванной клетке. Чувствительность гибридизационного метода, по сравнению с биотестом, при анализе ВКЭ в клещах была выше и при постановке биотеста на сосунках белых мышей, но в меньшей степени.

ЗАО «Вектор-Бест» для анализа РНК ВКЭ в клинических об­разцах поставляет тест-систему ПЦР-анализа в его наиболее выскочувствительном варианте, основанном на методе обратной транскрипции с последующей «nested» полимеразной цепной ре­ак­цией (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР включает два этапа: на первом этапе при температуре 37°С производится реакция обратной тран­ск­рипции, т.е. после специфического связывания олигонуклео­тида-праймера с вирусной РНК исследуемого образца происходит синтез вирусной кДНК с помощью обратной транскриптазы (ре­вер­тазы); на втором этапе проводится ПЦР, включающая три ста­дии. На первой стадии при температуре 93оС происходит дена­ту­рация гибридной двойной цепи РНК-кДНК, образовавшейся при обратной транскрипции. На второй стадии ПЦР два олиго­нуклеотида-праймера, строго специфичные (гомологичные) к опре­деленным участкам антипараллельных цепей вирусной РНК и кДНК, связываются с этими участками цепей нуклеиновых кис­лот (т.н. стадия отжига праймеров). На третьей стадии при темпе­ра­туре 70–72°С с участием термофильной ДНК-полимеразы (Тth-по­­лимераза) и дезоксинуклеозид-5’-трифосфатов происходит синтез новых цепей ДНК. Инициация синтеза ДНК происходит в местах связывания олигонуклеотидов-праймеров с вирусной РНК и кДНК, матрицей для копирования служат комплемен­тар­­ные цепи вирусной нуклеиновой кислоты (т.н. стадия полиме­ризации).

Таким образом, за цикл из трех стадий происходит удвоение каждого из двух фрагментов антипараллельных цепей вирусной нук­леиновой кислоты. При проведении 20 таких циклов теорети­чески происходит увеличение количества фрагмента исходной ДНК примерно в миллион раз.

Для увеличения чувствительности анализа этап ПЦР прово­дится в «nested»-варианте: первый раунд — с «внешней» парой оли­­гонуклеотидов-праймеров, второй раунд — с «внутренней» па­рой олигонуклеотидов-праймеров и аликвотой реакционной смеси ПЦР первого раунда.

Выбранные пары праймеров из NS3-области вирусного генома позволяют выявлять строго специфично все РНК ВКЭ различных штаммов. При этом РНК других флавивирусов, в том числе — из антигенной группы ВКЭ, не выявляются. Размер специфи­чес­кого ампликона в первом раунде ПЦР с «внешними» праймерами — 340 пар оснований, во втором раунде ПЦР с «внутренними» прай­­мерами — 171 пара оснований или нуклеотидных остатков. Де­текцию результатов ПЦР-анализа проводят визуально после гель-электрофореза аликвоты амплифицированной ДНК в поли­ак­­риламидном геле или агарозе. Чувствительность анализа с при­ме­нением описанной тест-системы — 100–200 геномов ВКЭ на ис­­следуемую пробу. Сверхчувствительный ПЦР-анализ РНК по­зво­ляет надежно с высокой специфичностью выявлять ВКЭ в ис­следуемых образцах, содержащих вирус в десятки-сотни тысяч раз в меньших количествах, чем это позволяет выявлять ИФА-ана­­лиз антигена ВКЭ.

Для проведения лабораторного ПЦР-анализа РНК ЗАО «Век­тор-Бест» выпускает дополнительный набор реагентов, специально предназначенный для выделения РНК из биологических образцов (крови, сывороток крови, форменных элементов крови, мочи, слю­ны, ликвора, соскобов со слизистой, культур клеток и пр.).

7.3. Лабораторная диагностика клещевого энцефалита

Внутри-, межочаговая и региональная генетическая гетеро­генность ВКЭ приводит к широкому структурному разно­об­разию эпитопов каждого из антигенов вируса. В результате сре­ди цир­ку­лирующих в природе штаммов вируса значительную часть сос­тав­ляют антигенно-дефектные варианты. Сущность яв­ле­ния анти­ген­ной дефектности заключается в отсутствии гемаг­глю­ти­нирую­щего и преципитирующего антигенов и слабой имму­ногенности на фоне высокой инфекционной активности вируса. В этих усло­виях основу иммунологических методов анализа спе­ци­фических вирусных антител составляют реакции связывания толь­ко вирус­нейтрализующих антител, продуцируемых у лиц, инфицирован­ных антигенно-дефектными вирусами в низких тит­рах. В при­род­ных популяциях ВКЭ доля соответствующих дефект­ных штам­мов может достигать 30–40% [29]. Лица, инфициро­ван­ные анти­генно-дефектными штаммами, в клинике образуют груп­пу т.н. серонегативных больных и больных с низкими ста­биль­ными титрами.

При иммунологических методах определения ВКЭ некоторая неопределенность в оценке результатов анализа также возникает из-за того, что препараты меченых антител могут связываться с вирусами различных серотипов ВКЭ с разной эффективностью. Так­же требуется проверка специфичности меченых антител от­но­сительно реакции связывания с другими флавивирусами группы клещевого энцефалита. По этим причинам в последнее время в про­изводстве ИФА-диагностикумов для клинического анализа в ка­честве меченых антител к ВКЭ используются моно­клональные ан­титела, связывающиеся с определенным эпитопом Е-антигена ВКЭ, общим для известных серотипов этого вируса.

Клиническое распознавание клещевого энцефалита на первом этапе основывается на известных клинико-эпидемиологических данных. В большинстве наблюдений удается установить пред­шест­­вующее пребывание человека в лесу, укус клеща или воз­мож­­ность употребления им сырого инфицированного молока. Сразу оценивается вероятная продолжительность инкубационного периода, а клинические исследования могут выявить нейроинфек­ци­онный характер болезни. Предварительный диагноз должен быть подтвержден лабораторным методом [3]. На практике диаг­ноз клещевого энцефалита, как правило, устанавливается приме­не­нием ИФА при четырехкратном нарастании титра вирусспе­ци­фических антител в парных сыворотках. Повторное обследование можно провести спустя 7–10 дней. Обычно антитела в высоких тит­рах обнаруживаются на 10–14-й день болезни, а иногда и раньше, и достигают высокого уровня к концу месяца. Даже однократное определение высокой концентрации вирусспецифи­ческих иммуноглобулинов класса IgM следует считать достоверным сви­детельством в пользу клинического диагноза клещевого эн­це­фа­лита. Ранние антитела IgM в сыворотке пациентов выявля­ются, начиная с первых дней после укуса клеща. Чувствитель­ность применения ИФА вирусспецифических антител класса IgM для диагностики максимальна в первой десятидневке после инфицирования. Антитела класса IgG в максимальных титрах вы­являются в течение 2–6 мес. после инфицирования. Однако, следует учитывать отсутствие антител или весьма низкий уровень продукции их у части больных в титрах не выше 1:640. При этом следует иметь в виду возможность обнаружения специфи­чес­ких антител в низких титрах в течение длительного времени у вакцинированных. Поэтому для подтверждения диагноза часто ре­комендуется применение высокочувствительного ПЦР-анализа для определения РНК ВКЭ. Определение вирусной РНК при клещевом энцефалите в образцах сыворотки, ликвора, в зависи­мос­ти от сроков выявления и корреляции с определенными соот­но­шениями уровней специфических антител IgM и IgG, может служить для диагностики серонегативной формы клещевого энце­фа­лита, затяжной реконвалесценции, прогноза второй волны лихо­радки клещевого энцефалита и возможности хронизации процесса [58, 82].

В последнее время ПЦР-анализ РНК ВКЭ, метод ИФА для ин­ди­кации вирусного антигена в клещах, снятых с людей, все чаще применяются для прогноза риска заболевания клещевым энце­фалитом. При положительных результатах тестирования ре­ко­­мендуется экстренная серопрофилактика укушенного путем внут­римышечного введения специфического противоэнцефа­лит­ного человеческого иммуноглобулина [59].

Дифференциальная диагностика должна учитывать возмож­ность заболевания пациента японским энцефалитом, геморраги­чес­кой лихорадкой с почечным синдромом, энтеровирусным менин­гитом, клещевым риккетсиозом, болезнью Лайма (боррелиозом) и др.

8. Средства специфической профилактики
и лечения клещевого энцефалита

8.1. Средства вакцино- и серопрофилактики

За более, чем полувековую историю противостояния человека инфекции клещевого энцефалита были предложены и апро­би­ро­ва­ны ряд широко распространенных мер как общей, неспеци­фи­чес­кой, так и специфической, или этиотропной, профилактики ин­фекции. Со временем практика постепенно меняет устано­вив­шиеся оценки эффективности и перспективности всех этих методов и процедур.

Неспецифический метод профилактики инфекции путем унич­тожения переносчиков вируса в природе был предложен еще в 1937–1938 гг. Лесные участки тогда предлагалось обрабатывать раст­ворами лизола, нафталина и фенола. Однако, позже наиболее эффективными средствами борьбы с этой природно-очаговой ин­фекцией были признаны и широко применялись в качестве ака­рицидов длительного действия ДДТ (дихлордифенилтрихлорэтан) и ГХЦГ (гехсахлорциклогексан) путем наземного и воздушного, при помощи авиации, опыления их в форме дуста на больших лес­ных площадях и пастбищах во многих регионах в 60-е годы прошлого века. Была показана высокая эффективность препаратов против кле­щей. Однако, наравне с заметным снижением забо­леваемости кле­ще­вым энцефалитом в ряде регионов страны, как показал и ми­ровой опыт применения этих препаратов в сельском хозяйстве и здравоохранении, была подтверждена их недопус­тимая вредность и опасность для окружающей среды и здоровья людей. После зап­рета применения и производства этих ядохи­микатов в настоя­щее время в России по медицинским показаниям продолжается противоклещевая обработка ограниченных терри­торий (летних детских оздоровительных лагерей, домов отдыха и санаториев) фос­форорганическими акарицидами ко­роткого срока действия, та­кими, как карбофос, трихлофос и др. [80].

К эффективным средствам неспецифической профилактики клещевого энцефалита также относятся санитарно-просвети­тельс­кая работа и меры индивидуальной и коллективной защиты от на­падения и присасывния клещей. Уже в первые годы изучения клещевого энцефалита было установлено, что при правильно орга­низованных взаимных осмотрах в лесу до 96,6% наползших кле­­­щей удалялись до того, как они успевали присосаться [52]. Еще в 30–40 гг. была доказана эффективность использования спе­циальной противоклещевой одежды и репеллентов. Считается, что необходимо применять отпугивающие средства, например, акарорепеллент мел «Претикс», даже если они не дают 100%-го эффекта.

Безусловно, наиболее эффективной и перспективной проти­во­энцефалитной защитой является повышение уровня иммунной прослойки населения и повышение сопротивляемости организма каж­дого индивидуума путем проведения специфической противо­ви­русной вакцино- и серопрофилактики клещевого энцефалита. Первый образец вакцины против клещевого энце­фалита был изготовлен на основе инактивированной фор­малином мозговой суспензии высоко репродуктивного дальневосточного штамма ВКЭ, накапливающегося в мозговой ткани зараженных в мозг бе­лых мышей. После обоснования в эксперименте на белых мышах безвредности и иммуногенности препарата его авторы Е.Н. Лев­ко­­вич и А.А. Смородинцев про­ве­рили безопасность вак­ци­ны на себе, а в дальнейшем на 10 волонтерах — сотрудниках ла­бо­ра­то­рии в 1939 г. Прививки не вызывали побочных местных или общих реакций. Через 21 день после иммунизации у боль­шинства привитых обнаруживался прирост вируснейтрализующих антител к ВКЭ. Тогда вакцина была разрешена для профилак­ти­чес­ких прививок участников дальневосточной экспедиции и насе­ле­ния Оборского очага клещевого энцефалита в крупном леспром­хо­зе не­далеко от г. Хабаровска. Учет заболеваемости в последую­щие 3 мес. показал высокую эффективность вакцинации. Среди 925 привитых было 2 легких случая энцефалита. В группе срав­не­ния у непривитых лиц на 1185 человек было диагностировано 27 заболеваний, в большинстве тяжелых, в т.ч. с 7 летальными исходами.

Существенным недостатком инактивированных вакцин пер­вых лет явилось значительное содержание в них балластной моз­го­вой ткани мышей, и как следствие, случались единичные гипер­эр­гические реакции на инородную ткань. Это явилось обоснованием для снижения содержания мозговой ткани в составе вакцины от 5 до 2,5% в 1958 г. Поскольку при массовой иммунизации убитой мозговой вакциной среди привитых в 1956–61 гг. было зарегист­ри­ровано 2 случая демиелинизирующего энцефалита, начались по­иски более безопасных подходов, разработки новой вакцины.

Перспективным направлением поисков была выбрана техно­ло­гия производства вакцинного вируса на тканевой культуре и его инактивация формалином. В бывшем Советском Союзе в 1962–69 гг. было выполнено большое количество наблюдений по изучению эффективности инактивированной культуральной вак­цины против клещевого энцефалита в различных очагах ин­фекции. В результате была рекомендована весьма громоздкая схе­ма вакцинации из 7 прививок, расчитанных на срок 4–5 лет. К концу периода 5-летней иммунизации у значительных кон­тин­гентов населения формируется полноценный иммунитет. По­сколь­ку вакцинация проводилась среди населения высокоэнде­мич­ных районов, по мнению А.А. Смородинцева и А.В. Дубова, высокий протективный эффект вакцины достигался в результате дополнительной реиммунизации людей местными природными штаммами вируса с доминирующим бессимптомным инфициро­ва­нием в естественных условиях [53].

По мнению этих авторов, изучение особенностей иммунитета, сти­мулируемого против ВКЭ с помощью инактивированных вак­цин, свидетельствует о выраженной неполноценности создаю­щейся защиты. Развивающийся общий гуморальный иммунитет кратко­вре­менен из-за быстрого падения уровня низкоавидных антител класса IgG. Клеточный иммунитет системы Т-лимфоцитов мало­активен в опытах адоптивного переноса этих клеток сингенным за­раженным мышам. В то же время, предварительная иммуни­за­ция мышей инактивированной вакциной создает надежный грун­диммунитет против штамма живого вируса, который утрачи­вает в этих условиях болезнетворные свойства, но стимулирует раз­витие высконапряженного иммунитета, подавляющего возмож­ность реинфицирования животных вирусами любой вирулент­ности. При этом следует обратить внимание на то, что высокая про­филактическая эффективность естественной вакцинации, по-видимому, может быть связана с поливалентным характером сум­мар­ного вирусного антигена, представляемого природным кле­ще­вым пулом ВКЭ.

Работы с такой предпосылкой по разработке живых вакцин на базе аттенуированных штаммов ТР-21 вируса Лангат и его ан­ти­генного близкого родственника штамма Эланцев ВКЭ из Си­бири остались не завершенными. В этих работах не был достигнут оптимальный уровень аттенуации или ослабления патогенности вирусов-кан­ди­датов в живые вакцины, позже сформулированный авторами. По мнению разработчиков, жи­вая вакцина при внутри­моз­говом заражении обезьян не долж­на вызывать не только ле­тальных исходов, но также клинических или патоморфоло­гичес­ких признаков поражения ЦНС при высо­кой активности стиму­ли­рования ею напряженного и длительного гуморального имму­нитета.

В настоящее время в сибирском регионе применяется инак­ти­вированная культуральная сорбированная на гидроокиси алю­миния вакцина на основе штамма 205 ВКЭ производства НИИ вак­цин и сывороток г. Томска. Полный курс вакцинации состоит из первичных трех инъекций и трех ежегодных однократных ревакцинаций. Вакцина имеет ограничивающие широкое при­ме­не­ние противопоказания. Общепризнанно, что среди вакцини­ру­е­мых регистрируются случаи клещевого энцефалита, однако, уро­вень заболеваемости у этой категории населения значительно ниже, чем у непривитых, и заболевания у привитых протекают легче. В то же время, в Институте полиомиелита и вирусных эн­­цефалитов АМН РФ был разработан метод концентрирования и очистки инактивированной культуральной вакцины ультрацент­рифугированием и хроматографией. Наиболее эффективной схемой прививок с высокоочищенной, высококонцентрированной вакци­ной показано двухкратное введение ее в дозах по 0,5 мл с 6-ме­­сяч­ными интервалами между прививками. В этом случае вируснейтрализующие антитела регистрировались в достаточно высоких титрах у 95% привитых. На российском рынке также известна инактивированная культуральная концентрированная вакцина против центрально-европейского энцефалита (западного генотипа ВКЭ) производства фирмы «Иммуно» из Австрии. Вы­со­коочищенный методом непрерывного зонального ультрацент­ри­фугирования препарат нанесен на гидроокись алюминия в ка­честве адъюванта и согласно регламента имеет эффективность около 97–98%. Применение этой вакцины не имеет медицинских противопоказаний и возрастных ограничений. Использование ее для массовой вакцинации населения в Австрии позволило снизить заболеваемость клещевым энцефалитом с относительно высоких показателей до спорадических случаев. Тем не менее инакти­ви­ро­ванные вакцины не свободны от принципиальных недостатков, как то: масштабное производство вакцины связано с инфекци­он­ными штаммами ВКЭ; остается риск неполноты инактивации вируса в готовом препарате; длительный курс иммунизации с введением нескольких доз вакцины.

По этим причинам продолжаются работы по поиску наиболее безопасных, высокоэффективных вакцин нового поколения на ос­нове современных биоинженерных технологий. Генно-инже­нер­ные субъединичные вакцины предлагаются на основе экспрес­си­рующего бакуловирусного вектора и в виде живой вакцины на ос­нове рекомбинантного вируса вакцины и других поксвирусных век­торов. Из живых рекомбинантных вакцин хорошими протек­тивными свойствами против клещевого энцефалита в эксперименте на мышах обладает химерный вирус осповакцины, несущий гены ВКЭ С-preM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3 и экспрессирующий белки Е и NS1 ВКЭ [62].

Также показана перспективность другого нового подхода профилактики клещевого энцефалита — с применением ДНК-вак­цины. Как сообщается [69], получены ДНК-конструкции, содержащие гены Е и NS1 ВКЭ, клонированием их в составе эу­ка­риотических экспрессирующих векторов pSVK3-E и pSVK3-ENS1, соответственно. Трансфекция клеток СПЭВ комплексом ре­комбинантная ДНК — катионный липид сопровождается син­тезом белков NS1 и NS3. Протективный эффект ДНК-вакцин тес­ти­ровали в эксперименте на мышах линии BALB/c внутри­мы­­шечным введением 5 раз по 100 мкг рекомбинантной ДНК и последующим заражением дозой 100 ЛД50 ВКЭ штамма Софьин. Прививки ДНК-вакцинами сопровождались существенным про­тек­тивным эффектом от инфекции, причем наибольший эффект получен при иммунизации рекомбинантной ДНК, содержащей гены Е и NS1 ВКЭ. В другой работе инокуляция при помощи ген­­ного ружья в эпидермальные клетки обезьян плазмидной ДНК, экспрессирующей РreM и E гены дальневосточного и западного штаммов ВКЭ, вызывает рост уровня вирусспецифических антител по ИФА и нейтрализующих вирус антител по тесту редукции бля­шек. Титр антител у животных, привитых ДНК-вакциной, был таким же, как у животных, инокулированных соответ­ст­вую­щей взрослому человеку дозой коммерческой инактиви­ро­ван­ной вакцины против клещевого энцефалита. Пассивный перенос сывороток от привитых ДНК-вакциной обезъян к мышам пол­ностью защищал мышей от инфекции западным и дальневос­точным штаммами ВКЭ [70].

Тем временем, вакцинация существующими препаратами ох­ва­тывает весьма ограниченный контингент населения, и забо­ле­вае­мость клещевым энцефалитом в Российской Федерации про­дол­­жает расти. В этих условиях остается весьма актуальным при­­­менение процедуры экстренной серопрофилактики специфи­чес­кими иммуноглобулинами против клещевого энцефалита лиц, подвергнувшихся присасыванию вирусофорного клеща. Показано, что пассивная иммунизация людей предварительно или сразу пос­ле укуса инфицированного клеща противовирусными анти­телами резко снижает заболеваемость клещевым энцефалитом и, как это подчеркивается, особенно снижает риск развития тяжелой нейроинфекции. Про­тек­тивный эффект достигается при введении специфических иммуноглобулинов, по возможности, в ранние сроки в течение двух-трех суток с момента присасывания клеща. Необходимость экстренной серопрофилактики устанавливается лабораторным анализом присосавшегося к коже человека клеща на наличие вируса. Уровень вирусофорности клещей, снятых с людей, зна­чительно выше, чем у их сородичей, собранных в лесу. Например, в 90-ые годы зараженность питавшихся на людях клещей состав­ляла 30–34% в окрестностях Иркутска, 18–21% в окрестностях Ангарска и 29–50% вблизи Томска [52, 59]. Час­­то по желанию укушенного экстренная серопрофилактика про­из­водится еще до лабораторного выявления инфицированности при­сосавшегося клеща. Титр специфических антител в препаратах человеческих иммуноглобулинов, выпускаемых в России, по регламенту уста­навливается не менее 1:80. В России также при­ме­няется препарат человеческих иммуноглобулинов против кле­щевого энцефалита FSME-BULIN производства фирмы «Immuno» c минимальным титром антител против ВКЭ 1:640. Эффектив­ность процедуры с этим препаратом оценивается от 60 до 70% [40]. Этот высоко­тит­ражный препарат рекомендуется применять не только после укуса клеща, но также перед сезонным наступ­лением заболевания или перед возможной экспозицией. Защитное действие данного препарата проявляется через 24 часа и продол­жается около 4 недель.

Перспективной мерой предварительной профилактики клеще­вого энцефалита представляется применение индукторов эндоген­ных интерферонов йодантипирина и амексина в форме таблеток. Если эти препараты берутся с собой в лес, то по обнаружении уку­са клеща профилактическая таблетка может быть принята на месте. Однако эффективность такой экстренной профилактики нуждается в изучении.

8.2. Средства этиотропной терапии клещевого энцефалита

По мнению А.П. Иерусалимского клиническое течение кле­ще­вого энцефалита далеко не стереотипно. Первые 2–4 дня забо­ле­вания еще не определяют ее клиническую форму и тяжесть. Ве­дущим в это время часто является лишь общеинфекционный синд­ром, а неврологические проявления могут быть еще впереди. Следовательно, каждого больного в этом периоде следует воспри­нимать как потенциально тяжелого и лечить соответственно. Учитывая избирательный тропизм ВКЭ к моторным стуктурам ЦНС, необходимо в остром (лихорадочном) периоде болезни предельно ограничить двигательную активность больного строгим постельным режимом и транспортировкой на носилках (при необходимости) [1].

Растущая заболеваемость и реальность развития тяжелой острой или хронической инфекции клещевого энцефалита не ос­тав­ляют сомнения в актуальности поиска новых средств и про­це­­­дур лечения. С целью выздоровления пациента или ремиссии бо­лезни разра­ботан стандарт (протокол) лечения клещевого эн­це­фалита, где решающая роль придается этиотропным средствам: иммуно­глобулинам человека против клещевого энцефалита, про­ти­воэн­це­фалитной иммунной плазме, интерферону (реаферону) и ри­бо­нук­леазе [63]. Применение этих основных средств наравне с дру­­гими патогенетическими лекарственными препаратами дози­ру­ется в зависимости от формы проявления инфекции. Иммуногло­бу­лины против ВКЭ прописываются для введения внутримышечно в течение 3-х дней: при лихорадочной и менингеальной формах болезни — по 3 мл, а при очаговой форме — от 6 до 12 мл в сут­­ки. Реаферон и его ректальная свечевая фор­ма виферон-250 про­писываются только для лечения ме­нин­геальной формы ин­фек­ции в 10, 13, 16 и 19-й дни. При тяжелой менингеальной и очаговой формах инфекции дополнительно к иммуноглобулинам предписано применение противоэнцефалитной иммунной плазмы в течение трех дней и рибонуклеазы в течение 5–7 дней. При тя­­­желой менингеальной и очаговой формах болез­ни пациентам пред­писано одновременное лечение кортикос­теро­идным иммуно­депрессантом преднизолоном внутривенно в течение 3–7 дней.

Предусмотренная продолжительность стационарного лечения для лихорадочной формы инфекции средней тяжести — 14 дней, при менингеальной форме средней тяжести — 21 день, при тя­же­­­лой — 30 дней. При очаговых менингоэнцефалитической и по­лио­миелитической формах ВКЭ-инфекции средней тяжести — 35 дней, при тяжелой — 50 дней.

Несмотря на положительный клинический эффект и много­летний опыт использования специфических серопрепаратов для лечения клещевого энцефалита, по мнению авторов статьи [64], до настоящего времени в литературе появляются разноречивые све­дения о возможных последствиях их применения. На Дальнем Востоке на долю клинических форм с тяжелым поражением мозга приходится более 50% случаев, из них в 25% случаев и более от­ме­чается летальный исход. На территории Сибири доминируют лихорадочные и стертые формы, тяжело протекающие случаи клещевого энцефалита встречаются довольно редко. Результаты многочисленных наблюдений по использованию специфических иммуноглобулинов на разных территориях страны не всегда сов­падают. Согласно методическим рекомендациям, разрабо­тан­ным в Омске, в тяжелых случаях при очаговых формах этой инфекции с поражением оболочки и вещества мозга максимальная курсовая доза иммуноглобулинов составляет до 60 мл. В то же вре­мя, даль­­­невосточные клиницисты для таких случаев предла­гают опти­мальную схему с курсовой дозой до 120 мл. В этом пла­не клини­чес­кие и экспериментальные исследования по обос­но­ванию опти­мальных схем применения специфических иммуно­глобулинов с уве­личением ранее рекомендованных курсовых доз препарата продолжаются.

Эксперименты по поискам оптимальных лечебных доз имму­ноглобулинов на модели золотистых хомячков, инфицированных высоковирулентными дальневосточными штаммами ВКЭ Пи­щел­кин и 155, свидетельствуют о значительных вариациях лечебного эффекта разных доз препарата. Прежде всего, отмечается ухуд­шение тех или иных показателей при воздействии меньшей лечебной дозы (0,1 мл препарата на животное, что соответствует 60 мл препарата для взрослого человека) иммуноглобулинов на оба штамма ВКЭ, использованных в опыте. Более глубокие па­то­­логические нарушения отмечены у хомячков, зараженных штам­мом 155 и леченных иммуноглобулинами, особенно в малой дозе 0,1 мл. На основании этих данных в клинической практике у больных с признаками бульбарных нарушений и хотя бы мини­мальными симптомами, свидетельствующими о вовлечении в про­цесс ствола мозга, применение серотерапии оспаривается. Отчет­ливая картина эффективности иммунотерапии в дозе 0,2 мл была получена на модели хомячков, зараженных менее вирулентным штаммом Пищелкин ВКЭ. Как подчеркивается авторами [64], назначение иммунопрепаратов в недостаточном количестве, а еще хуже с низкими титрами антител, как правило, может обусловить образование патогенных иммунных комплексов, которые спо­соб­ствуют формированию длительной персистенции вируса и хронизации инфекционного процесса. Как известно из патогенеза инфекции, такие комплексы образуются на ранних этапах ин­фек­ционного процесса, когда в крови присутствует лишь незна­чительное количество противовирусных антител. При увеличении концентрации циркулирующих антител количество комплексов с избыточным содержанием вируса уменьшается и полностью ис­чезает.

В связи с этим обращается внимание на применение низко­титражных препаратов иммуноглобулинов (1:20 и 1:40) для про­­­­фи­лактики клещевого энцефалита с низкой протективной (5–14,4%) эффективностью. Такая практика может только диск­редитировать специфическую экстренную иммунопрофилактику, по сути способствуя активизации инфекционного процесса или возникновению длительной персистенции вируса. Как отмечается, при применении высокотитражного австрийского препарата им­му­ноглобулинов против ВКЭ-инфекции из расчета 0,1 мл/кг мас­сы в первые сутки и 0,2 мл/кг массы тела во 2–4-ые сутки пос­ле укуса клеща не было выявлено ни одного случая забо­левания.

А.П. Иерусалимский в своей монографии [1] список выше упомянутых этиотропных средств лечения клещевого энцефалита расширяет индукторами интерферона ридостином, йодантипи­ри­ном и амексином с описаниями схем их применения. Кроме того, для лечения больных с тяжелым течением клещевого энцефалита ав­тором совместно с А.К. Ровиной, Л.О. Чернициной и др. разра­бо­тан новый вариант серотерапии, сочетанный с гемосорбцией — экстракорпоральная иммуногемосорбция. На угольный сорбент СУМС-1 в пропорции 4:1 наносится противоэнцефалитный лечеб­ный иммуноглобулин высокого титра. Затем через иммуногемо­сорбент вено-венозным споособом проводится гемосорбция со скоростью 80 мл/мин в объеме 1,0–1,5 ОЦК. Показаниями для новой лечебной процедуры являются данные клинические и ла­бо­раторные, говорящие о тяжести состояния больного: высокая ли­хорадка, нарушения сознания различной степени, судорожный синдром, содержания мочевины и билирубина, превышающие норму, высокие цифры лейкоцитарного индекса интоксикации, концентрация молекул средней массы в крови более 0,26 удельных единиц. Метод клинически апробирован на 28 больных с тяжелым течением клещевого энцефалита (преимущественно менингоэнце­фалитичской формы). По сравнению с простой гемосорбцией до­с­ти­гается гораздо большая эффективность: после однократной им­му­ногемосорбции определяется чистый фон по содержанию РНК ВКЭ в крови, в более короткий срок регрессировала невроло­ги­ческая симптоматика, уменьшается степень нарушения сознания, продолжительность коматозного состояния.

9. Заключение

Природно-очаговая нейровирусная инфекция клещевого энцефалита распространена по всей умеренно-климатической лес­ной и лесостепной зоне Евразийского континента и за его преде­лами, от японского острова Хоккайдо на востоке и до островов Ве­ликобритании на западе. Однако, наиболее высокоэндемичными по клещевому энцефалиту территориями являются Уральский, Сибирский и Дальневосточный регионы Российской Федерации. На южном и среднем Урале, юге Западной Сибири установлена наиболее высокая распространенность инфекции. На Дальнем Востоке клещевой энцефалит протекает в более тяжелой форме с частыми ле­тальными исходами, а на юге Восточной Сибири на­равне с высокой распространенностью инфекции характерна ее частая хро­низация. Сезонное заболевание весенне-летнего энце­фалита пов­сюду распространяется носителями вируса в природе — ик­со­до­выми клещами. На европейской части территории ос­новным носи­телем вируса является лесной клещ I. ricinus, а на азиатской части ареала — таежно-луговой клещ I. persulcatus.

На основании анализа многолетних клинических данных, по­лученных в своей работе по лечению больных клещевым энцефалитом, а также с учетом результатов многочисленных работ по повсеместному изучению особенностей этой нейроинфекции в течение десятилетий другими врачами, А.П. Иерусалимский при­ходит к заключению о том, что различия клиники клещевого эн­­це­фалита в разных отдаленных географических районах его ареа­ла, различия клиники, связанные с особенностями ланд­шафта в близлежащих районах и изменение клиники заболевания в одном очаге с течением времени отражают собой единый процесс — эволюцию природно-очаговой инфекции.

Молекулярно-генетическое изучение ВКЭ показало гетеро­ген­ность и изменчивость вирусного генома. Широкая гетероген­ность первичной структуры генома ВКЭ поддерживается пассиро­ва­нием вируса через организм членистоногих в процессе естест­венной циркуляции вируса по схеме клещ–животное-про­кор­ми­тель–клещ. С гетерогенностью вирусного генома связана неодно­род­ная антигенная структура клещевого пула вируса в природном очаге инфекции. Штаммы вируса внутри каждого очага отлича­ют­ся инфекционными, иммуногенными и иммуно- и нейропато­генными свойствами. И, как следствие, повсеместно наблюдается широкое разнообразие форм и клинических проявлений острого клещевого энцефалита: от латентных, субклинических, умерен­ных лихорадочных, менин­геальных и до менингоэнце­фалити­чес­ких и полиомиели­ти­ческих очаговых тяжелых форм энцефалита, а в некоторых мес­тах — еще с развитием клинической инфекции с двухволновой лихорад­кой. В то же время результаты широких мо­лекулярно-эпидемио­логических и серологических исследований инфекции показали наличие различных генотипов и соответст­вую­щих анти­генных серотипов ВКЭ на удаленных друг от друга об­ширных территориях. Таким образом, достоверные отличи­тель­ные особен­ности в клинических проявлениях инфекции, в тя­жести ее проте­кания, ее хронизации и др. между различными удаленными друг от друга эндемичными регионами могли быть связаны с наличием эволюционных генотипических отличий возбудителя инфекции на фоне природно-очаговых особенностей клещевого пула вируса на территории.

Изучение доменных объемно-структурных и антигенно-эпи­топ­ных свойств поверхностного белка Е ВКЭ с применением рент­ге­ноструктурных и МКА-исследований, идентификация специ­фи­ческих детерминант вирулентности с помощью сайт-направ­лен­­­ных мутаций в гене Е в инфекционных кДНК клонах в экспе­рименте показали исключительно большую роль белка Е, как в оп­ределении клеточного тропизма, способности к индукции нейт­рализующих и элиминирующих вирус из организма антител, так и в определении нейропатогенных свойств вируса. Применение тех­­нологии клонирования инфекционных кДНК в эксперименте для картирования детерминант нейроинвазивности и нейрови­ру­лентности ВКЭ на поверхности белка Е раскрывает молекулярные основы нейропатогенных свойств флавивирусов.

Изучение молекулярной биологии ВКЭ, выявление молеку­лярно-генетической гетерогенности клещевого пула вируса и его соответствующих патегенетических свойств, их изменчивости в результате пассирования вируса в клещах — носителях вируса и через позвоночных прокормителей инфицированного вирусом клеща, экспериментальное молекулярно-биологическое изучение мутационной природы изменчивости патогенетических свойств ВКЭ позволяют предполагать, что выявленная эволюция клини­ческих особенностей инфекции клещевого энцефалита связана, прежде всего, с эволюцией генома ее возбудителя и соответст­вую­щей антигенной структуры, иммуногенных свойств ВКЭ под воз­действием быстро изменяющихся природных условий в антро­пургических очагах инфекции клещевого энцефалита.

В настоящее время явно отстает клиническое и эксперимен­тальное исследование патогенеза ВКЭ-инфекции с применением современных лабораторных молекулярно-биологических, сероло­гических и клинических иммунометрических методов. До сих пор нет результатов измерения динамики вирусологических анти­генных, генетических и иммунологических маркеров с генотипи­рованием иммуноцитов пациента в ходе инфекции, с одновремен­ным прослеживанием индукции иммунорегуляторных цитокинов, интерлейкинов и других воспалительных и апоптозных медиато­ров цитолиза инфицированных клеток и некроза тканей. Вслед­ствие этого в литературе имеются только разрозненные отдельные сведения о репликативной, персистентной и интегративной ин­фекции, процессах иммуно- и нейропатологии, клеточно-гумо­раль­ном защитном иммунитете, об ассоциативных наследст­венных факторах и о стадиях острой и хронической ВКЭ-инфекции. Для составления единого вирусоиммуногенетического представления о патогенезе клещевого энцефалита прежде всего недостаточно информации о механизме персистентной инфекции. По-видимому, именно условия персистентной инфекции обеспечивают взаимную адаптацию вируса и макроорганизма на длительное сосущество­вание, переведя быструю репликативную инфекцию воспроиз­вод­ства полноценного вируса на медленную персистентную инфекцию с продукцией дефектных интерферирующих вирусных частиц при условии длительной сохранности вирусного генома в инфициро­ванной клетке и реализации механизма иммунной толерантности макроорганизма. Возможно, за перевод репликативной инфекции в режим персистентной инфекции ответственен еще не изученный участок клеточного генома человека, аналогичный локусу Flv у мы­ши, резистентной к флавивирусной инфекции.

Для решения практической задачи клинического прогноза развития и исхода инфекции клещевого энцефалита представ­ля­ется целесообразным проведение широких лабораторных иссле­дований комплекса вирусологических, иммунологических и бихимических маркеров инфекции в динамике с применением но­вых методов ИФА и ПЦР-анализа, клинической иммунологии и биохимии. В результате могут быть установлены общие законо­мерности изменения маркеров инфекции и сформулирован опти­мальный алгоритм развития последовательных стадий острой цик­­лической инфекции клещевого энцефалита с учетом ее кли­нических особенностей. В дальнейшем, при комплексном лабора­торном обследовании каждого пациента существенные отклонения или тенденции к отклонению динамических параметров основных маркеров в ходе инфекции от соответствующих характеристик оптимального алгоритма могут быть расшифрованы как вероятные предикторы необратимого осложнения острой инфекции или про­гре­диентного течения инфекции, ведущей к хроническому энце­фалиту у больного.

Применение тест-систем ИФА и ПЦР-анализа соответствую­щих лабораторных маркеров клещевого энцефалита в настоящее время позволяет успешно разрешить задачи дифференциальной диагностики ВКЭ-инфекции. Методы ИФА-диагностики также могут быть использованы для изучения эффективности курса этиотропного лечения, скрининга населения с целью выявления лиц с иммунным статусом, не восприимчивых

к ВКЭ-инфекции, и не нуждающихся в этиотропной профилактике. Средства пас­сив­ной и активной профилактики клещевого энцефалита, разрабо­танные в России до сих пор, по своим качествам не отвечают пол­ностью высоким требованиям, предъявляемым к ним в настоя­щее время. Работы по усовершенствованию технологии изготов­ления, поискам новых средств профилактики и лечения клещевого энцефалита продолжаются очень медленными темпами.

Финансовый аспект проблемы защиты от клещевого энце­фа­лита для работающей части населения сегодня решается со сто­роны рабо­тодателей. Для остальной части населения предвари­тельная активная вакцинопрофилактика и пассивная, экстренная серопро­филактика укушенных клещом от клещевого энцефалита может про­водиться, в основном, за счет местных и централизо­ван­ных бюджетных средств.

Растущая год от года заболеваемость клещевым энцефалитом, частые случаи тяжелого течения болезни и смертельные исходы при этом, постоянный рост числа инвалидов и лиц с ограни­чен­ны­ми физическими возможностями с неизлеченным хроническим энцефалитом в России говорят о том, что до сих наше общество и государство не прилагают адекватных усилий для разрешения проб­лемы клещевого энцефалита в стране.

 

 Страница интересных статей